補腎解毒方調控IL-12、IFN-γ水平對輻射后小鼠免疫防護作用研究*

杜 磊,李延暉,楊云霜,張 蓉△

1.北京市隆福醫院治未病科(北京 100010);2.火箭軍特色醫學中心中醫科 (北京 100088)

隨著各行業領域對核能的不斷開發利用，人們遭受核輻射的潛在風險日益增加，免疫系統是對核輻射損傷最敏感的組織器官。IL-12、IFN-γ是細胞免疫過程中的關鍵調節因子，IFN-γ不僅具有相關免疫活性,而且可作用于多種參與更新和重建的細胞體系中，影響其分化和形成，二者共同誘導Th0向Th1分化，刺激免疫應答。我們前期研究發現，補腎解毒方能減輕輻射后小鼠脾、胸腺等免疫器官損傷[1-2],基于此，本實驗通過檢測IL-12、IFN-γ分泌水平的變化，探究此方對輻射后小鼠免疫系統的防護機制。

材料與方法

1 動 物 SPF級C57BL/10J小鼠，8周齡，體質量(25±3) g，南京大學生物醫藥研究院提供，動物合格證號：[SCXK(蘇)2018-0008]。飼養于北京師范大學生命科學院實驗動物中心，自由攝食進水。

2 試 藥 補腎解毒方顆粒組成：山萸肉12 g，熟地黃、山藥、牡丹皮、澤瀉、茯苓、白花蛇舌草各10 g,冬蟲夏草3 g。由康仁堂藥業有限公司制成中藥顆粒制劑。將上方顆粒與無菌水混合煎煮，過濾，濃縮濾液配置出濃度為1.38 g/ml藥液，分裝置4 ℃冰箱保存。IL-12 ELISA試劑盒(規格型號：96T，北京瑞格博科技發展有限公司)，IFN-γ ELISA試劑盒(規格型號：96T，北京瑞格博科技發展有限公司)。

3 儀 器60Coγ-輻射裝置(北京伽瑪高新有限公司生產，型號：GM-11-03-A),由北京師范大學化學學院提供，高速臺式冷凍離心機(上海天美科學儀器有限公司,型號:CT15RT)。

4 分組、造模及給藥 90只C57BL/10J小鼠隨機分為五組：空白組、輻射組、氨磷汀組、補腎解毒方防治結合組和補腎解毒方預防組,每組18只。防治組與預防組小鼠每日予以補腎解毒方濾液灌胃(0.25 ml/只)，余三組予以等容積生理鹽水灌胃，連續給藥10 d，第11天，除空白組外所有小鼠接受與照射源等距離的一次性4Gy60Co γ-射線全身照射，同時氨磷汀組小鼠在輻射前30 min內按照200 mg/kg體重常規劑量注射氨磷汀。照射后，防治組繼續給予補腎解毒方濾液灌胃，余四組予以等容積生理鹽水灌胃,并于輻射后第1、7、14天取材，眼球取血，分離血清，采用ELISA法檢測血清中IL-12、IFN-γ水平。

5 血清IL-12、IFN-γ水平測定 血液在室溫下自然凝固20 min，放入離心機離心15 min(3000轉/ min)，收集上清，應用ELISA法，根據標準曲線的回歸方程，計算出小鼠血清IL-12、IFN-γ水平。嚴格按照試劑盒操作步驟進行。

結 果

1 補腎解毒方對輻射小鼠血清IL-12水平的影響 表1顯示，輻射后第1天，氨磷汀組IL-12水平高于輻射組(P<0.05)；輻射后第7天，防治組IL-12水平高于輻射組(P<0.05)；輻射后第14天，各組間無統計學差異。

2 補腎解毒方對輻射小鼠血清IFN-γ水平的影響 表2顯示，輻射后第1天、14天，各組間比較無統計學差異；輻射后第7天，防治組IFN-γ水平高于輻射組與氨磷汀組(P<0.01，P<0.05)，同時預防組高于輻射組(P<0.05)，空白組高于輻射組和氨磷汀組(P<0.05)。

表1 補腎解毒方對輻射小鼠血清IL-12水平的影響(ng/L)

注：同時間點各組與輻射組比較，*P<0.05

表2 補腎解毒方對輻射小鼠血清IFN-γ水平的影響(ng/L)

注：同時間點與空白組比較，▲P<0.05；同時間點與輻射組比較，*P<0.05；同時間點與氨磷汀組比較，△P<0.05

討 論

免疫系統是對輻射高度敏感的靶器官，輻射產生過量自由基，通過能量的大量傳遞，導致DNA雙鏈結構斷裂(Double-strandbreaks,DSBs)和生物大分子損傷,誘導免疫細胞凋亡，對免疫系統造成傷害[3-4]。

IL-12、IFN-γ是由多種細胞產生的低分子量可溶性蛋白質，二者共同促進機體細胞功能彼此協調和發揮效應，具有調節固有免疫和適應性免疫的功能[5]。IL-12為由p35-p40亞單位組成的異質二聚體，國內外研究發現[6-8]，IL-12可調節Th1/Th2平衡，同時增加Th1型因子，如IFN-γ的分泌[9]，是免疫應答過程中的重要調節因子。IFN-γ作為重要的宿主免疫防御環節，功能廣泛，Nakanishi等[10-11]發現，它可促進MHC分子表達和抗原提呈，誘導Th1細胞分化，抑制Th2細胞分化。多項動物實驗證明[12]：IFN-γ基因敲除小鼠免疫能力弱于正常鼠。故二者在免疫過程中發揮著不可替代的作用。

實驗中觀察到小鼠受輻射后多有食欲減退、出血、皮膚毛發損害等癥狀，而臨床中的輻射病也多見惡心、嘔吐、出血、皮膚燒燙傷、毛發脫落等癥狀，因此由癥狀推求病因，可知輻射在中醫病因中歸類于火熱毒邪一類，其特性暴戾猛烈、耗氣傷精，易燔灼營血，致肝腎之精血枯竭，治當滋陰填精，清熱解毒。補腎解毒方由滋補腎陰經典方六味地黃丸化裁而來，六味地黃丸肝脾腎并補，尤善補腎之真陰，考慮到火熱毒邪最易耗傷腎陰根本，故補腎之真陰成為防治輻射后機體的免疫損傷的關鍵方面[13]。國內外多項研究證明[14-15]，六味地黃丸有促進新陳代謝、調節免疫、抗腫瘤等作用?？紤]到熟地滋膩礙胃的特性，在此基礎上，我們將熟地減量至10 g，以減輕輻射后胃腸道的負擔，并加入冬蟲夏草3 g，白花蛇舌草10 g；冬蟲夏草首載于《本草從新》，補腎益肺，專補命門，主要活性成分真菌多糖、蟲草酸可提高骨髓造血功能，抑制癌細胞分裂[16]，Hwang等[17]研究發現，這些主要活性成分還具有抗氧化、提高免疫力的功能。白花蛇舌草具有清熱解毒、利濕通淋之效，參與內皮細胞的增殖凋亡，內含總黃酮成分能促進IL-12、IFN-γ等細胞因子的增多[18]。諸藥合用，共奏扶正祛邪之功。

實驗結果顯示,輻射后第1d，氨磷汀組IL-12水平高于輻射組，各組間IFN-γ水平比較無統計學差異；表明補腎解毒方對輻射急性期IL-12、IFN-γ無明顯影響，氨磷汀上調了IL-12水平，表現出防護作用。輻射后第7天，防治組IL-12水平高于輻射組，IFN-γ水平防治組高于輻射組與氨磷汀組，同時預防組高于輻射組，空白組高于輻射組和氨磷汀組，防治組效果最優，預防組次之。表明輻射中期，補腎解毒方能提高IL-12、IFN-γ水平，促進輻射后機體損傷的修復，且輻射后繼續給藥能發揮最佳防護效果，氨磷汀作為目前最常用的輻射防護劑，目前在臨床上僅應用于大量接觸射線之前的患者，輻射之后給藥則未顯現療效，而中藥在輻射前后均能發揮療效。輻射后第14天，各組IL-12、IFN-γ水平比較無統計學差異，表明了機體自身修復能力，中低劑量照射后，無論是否用藥，隨著自我修復的啟動，各項指標逐漸趨于正常。

綜上，補腎解毒方顆粒能提高輻射后小鼠血清中IL-12、IFN-γ的分泌水平，增強機體免疫力，為我們未來進一步發掘此方對輻射后的免疫防護機制奠定了堅實的基礎。