紫柏凝膠通過調節ERK及P38/MAPK信號通路下調宮頸癌荷瘤裸鼠E6、E7蛋白表達研究*

溫利娟,薛曉鷗,馬秀麗,米 鑫,謝 偉

1.北京市順義區婦幼保健院(北京101300);2.北京中醫藥大學東直門醫院(北京100700)

宮頸癌是女性惡性腫瘤發病率第2位的腫瘤，根據世界衛生組織(WHO)的數據，每年約25萬女性死于宮頸癌[1-2]。ERK及P38是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員，參與了細胞的生長、發育等生理過程，在細胞惡性轉化過程中起著關鍵性作用。目前ERK及 P38信號通路的研究對腫瘤防治工作有重要意義[3]。

名老中醫郭志強教授創立了紫草散治療宮頸HPV感染，經薛曉鷗教授團隊劑型優化為紫柏凝膠，前期實驗研究表明紫柏凝膠可抑制宮頸癌Siha細胞增殖，促進細胞凋亡[4]。然而，紫柏凝膠治療宮頸癌的具體機制尚不明確。本實驗旨在通過研究建立人宮頸癌裸鼠荷瘤模型，觀察ERK及P38/MAPK信號通路在紫柏凝膠影響宮頸癌裸鼠移植瘤致癌蛋白E6、E7 表達中的作用，以期從分子生物學水平為闡明紫柏凝膠治療宮頸癌作用機制。

材料與方法

1 動 物 35只SPF級BALB/c(nu/nu)雌性裸小鼠，5～6周齡，體質量16～18 g，由維通利華實驗動物中心提供(動物合格證號:SCXK(京) 2012-0001)。醫學實驗動物使用許可證編號：SYXK( 京) 20120028。

2 細胞株 宮頸癌Siha細胞株購自上海復祥生物科技有限公司。

3 藥 物 紫柏凝膠由紫草、黃柏、莪術、銀花、苦參、百部、兒茶、白及、冰片九味中藥組成，藥物比例為20∶20∶20∶20∶20∶20∶15∶6∶2，飲片由北京中醫藥大學附屬東直門醫院藥劑科提供，按工藝提取后制作而成，由北京百川飛虹技術有限公司生產(15 g/瓶，含生藥量約2.7 g，批次號：20160501)。注射用順鉑，10 mg/支，齊魯制藥有限公司(生產批號：H37021358)。

4 主要試劑及儀器 抗人乳頭瘤病毒16(E7)抗體(英國abcam公司)，山羊抗兔 IgG(英國abcam公司)，山羊抗鼠 IgG(英國abcam公司)，抗人乳頭瘤病毒16(E6)，18(E6)抗體(英國abcam公司)，抗p-ERK抗體(英國abcam公司)，抗p-p38抗體(英國abcam公司)，免疫組化試劑盒(北京中衫生物科技有限公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon)，細胞培養箱( 德國Thermo公司)，生物潔凈使用超凈臺(杭州Opti MAIR公司)。

5 Siha細胞懸液制備方法 Siha細胞株復蘇→細胞培養→對數生長期細胞→胰酶消化→離心→丟上清→懸浮細胞→細胞計數。培養條件：含10%胎牛血清DMEM液、100 mg/ml濃度的鏈霉素和青霉素，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱內培養。最后調整細胞濃度2×107/ml。

6 模型制備及分組方法 無菌條件下，用0.5 ml注射器抽取0.2 ml(濃度為2×107/ml)Siha細胞懸液，并注射于裸鼠右前肢腋窩。皮下結節直徑>0.5 cm為成瘤標準[5]，飼養于SPF環境，觀察裸鼠生長狀態及腫瘤生長情況。本實驗共35只裸鼠成瘤率為100%。成瘤后將裸鼠稱重，用隨機數字表法分成紫柏凝膠高、中、低劑量組，順鉑組及模型組，每組7只。

7 干預方法 紫柏凝膠各劑量組分別用無菌棉簽在瘤體表面涂抹紫柏凝膠0.9428(相當臨床劑量的2倍)、0.4714(等同于臨床劑量)、0.2357(相當于臨床劑量的1/2)g/kg，1 d/次；順鉑組腹腔內注射0.5 ml順鉑5 mg/kg，相當于臨床化療方案中 100 mg /(m2·d)用量，4 d/次；模型組不干預。各組均干預4周。

8 觀察指標

8.1 一般觀察指標:包括裸鼠精神狀態、反應力、活動力、飲食情況，同時包含抑制瘤皮下種植區外觀及觸感。治療過程中死亡裸鼠均行解剖以明確死因。

8.2 裸鼠體質量及瘤體體積:測量每日用藥前裸鼠體質量，并測量裸鼠瘤體的長徑(a)和短徑(b)，計算腫瘤體積(V)，V=ab2/2。

8.3 瘤重及抑瘤率檢測:停藥24 h后，頸椎脫臼法處死裸鼠，完整剝取瘤組織，測量體積并稱瘤重。抑瘤率(%)：[(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重]×100%。

8.4 瘤體組織病理學觀察:采用HE染色法。常規石蠟包埋，切片厚度4 μm，二甲苯去蠟處理，乙醇及蒸餾水清洗切片，蘇木精液染色，流水及蒸餾水沖洗。0.5%伊紅液染色，乙醇清洗。中性樹膠封固[6]。

8.5 免疫組化法檢測瘤組織中E6、E7、p-ERK和p-p38蛋白表達:采用免疫組化SP法，第1天行組織切片，脫蠟，滅活，熱修復抗原處理，室溫內靜置冷卻，PBS清洗；滴加5%BSA封閉液室溫放置；滴加一抗后切片放置于4 ℃冰箱過夜[7]。第2天清洗后滴加二抗，室溫放置后清洗，滴加SABC，室溫放置后清洗，DAB室溫顯色后中止反應，蘇木素輕度復染后中止反應，切片放入酒精中，中性樹膠封片。

9 判定標準 免疫組化法檢測下p-ERK、p-p38、E6和E7蛋白表達水平，結果判讀采用人工計數方法，即根據染色強度和陽性細胞的比例評分。所有切片的觀察經三名研究人員獨立在光鏡下完成，隨機選擇高倍視野共10個，計算的陽性細胞比例；>75記4分；50%～75%記3分；25%～50%記2分；5%～25%記1分；<5%記0分。染色強度：棕褐色為3分；棕黃色為2分；淺黃色或黃色為1分；無顯色為0分。蛋白表達水平=染色強度×陽性細胞比例。光鏡下以上各蛋白陽性細胞表現為細胞膜或細胞漿呈棕黃色[8]。

結 果

1 各組裸鼠一般狀態比較 Siha細胞接種后，2 d裸鼠皮膚種植區呈白色，5～6 d種植區皮下可觸及2～3 mm結節，質韌，7～8 d結節直徑達5 mm，質地略硬。順鉑組裸鼠在7 d出現飲食量及活動量明顯減少，形體消瘦，該組2只裸鼠分別治療在17、18 d死亡，解剖肝腎等內臟未見明顯異常，考慮為化療不良反應致死。其余各組裸鼠無明顯消瘦，無死亡。

2 各組裸鼠瘤重及抑瘤率比較 見表1。 與模型組比較，順鉑組及紫柏凝膠高、中劑量組瘤重降低(P<0.05)。與順鉑組比較，各劑量紫柏凝膠組瘤重升高(P<0.05)，抑瘤率降低(P<0.05)。與低劑量紫柏凝膠組比較，中、高劑量紫柏凝膠組瘤重降低(P<0.05)，抑瘤率升高(P<0.05)。

3 各組裸鼠移植瘤組織肉眼及鏡下觀察 肉眼觀察，移植瘤組織呈結節狀，切面呈魚肉樣，伴見局灶性壞死。顯微鏡下觀察腫瘤細胞呈簇團狀、漩渦狀生長，細胞呈卵圓形或圓形，核大，見病理性核分裂，細胞核染色加深，見核固縮、溶解、碎裂瘤團間可見壞死病灶形成，呈均質紅染色樣。順鉑組腫瘤組織壞死區域增大較為明顯，紫柏凝膠各劑量組腫瘤組織壞死區域面積與劑量呈正比關系(圖1)。

表1 各組裸鼠瘤重及抑瘤率比較

注：與模型組比較， *P<0.05；與順鉑組比較，△P<0.05；與低劑量紫柏凝膠組比較，▲P<0.05

A：模型組；B：紫柏凝膠低劑量組；C：紫柏凝膠中劑量組；D：紫柏凝膠高劑量組； E：為順鉑組。箭頭所指為腫瘤壞死細胞

4 紫柏凝膠對E6、E7蛋白表達的影響 見表2、3。 與模型組比較，中劑量、高劑量紫柏凝膠組及順鉑組E6蛋白表達均明顯降低(P<0.05)，高劑量紫柏凝膠組及順鉑組E7蛋白表達均明顯降低(P<0.05)；與順鉑組相比，紫柏凝膠各組E6表達上升(P<0.05)，紫柏凝膠各組E7表達上升(P<0.05)；與低劑量紫柏凝膠組比較，中、高劑量紫柏凝膠組E6蛋白表達均明顯降低(P<0.05)，中、高劑量紫柏凝膠組E7蛋白表達均明顯降低(P<0.05)。提示紫柏凝膠有下調E6、E7蛋白表達的作用(圖2)。

5 紫柏凝膠對ERK及P38/MAPK信號相關蛋白表達的影響 見表2、3。

表2 各組平均陽性細胞染色強度比較(分)

注：與模型組比較， *P<0.05；與順鉑組比較，▲P<0.05；與低劑量紫柏凝膠組比較，△P<0.05

表3 各組E6、E7、p-ERK、p-p38蛋白表達比較(分)

注：與模型組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，▲P<0.05；與低劑量紫柏凝膠組比較，△P<0.05

與模型組比較，中、高劑量紫柏凝膠組及順鉑組p-ERK及p-p38蛋白表達均明顯下降(P<0.05)；與順鉑組比，紫柏凝膠各組p-ERK及p-p38蛋白表達上升(P<0.05)；與低劑量紫柏凝膠組比較，中、高劑量組及順鉑組蛋白表達均明顯下降(P<0.05)。提示紫柏凝膠有下調p-ERK及p-p38蛋白表達的作用(圖2)。

A：紫柏凝膠高劑量組；B：紫柏凝膠中劑量組；C：紫柏凝膠低劑量組；D：為模型組； 1：E6蛋白； 2： E7蛋白； 3：p-ERK蛋白； 4：p-p38蛋白；箭頭所指為蛋白表達

圖2 各組裸鼠E6、E7、p-ERK、p-p38免疫組化染色蛋白表達結果(免疫組化染色，×200)

討 論

中醫古籍并無“宮頸癌”這一病名，其屬于中醫“崩漏”及“癥瘕病”疾病[9]，名老中醫郭志強教授認為該病的主要病機是正氣邪盛，邪毒瘀阻于胞中[10]。在宮頸癌患者手術、放化療中，采用中醫四診合參，辨證論治后治以扶正祛邪，中醫方法的干預，可有效改善宮頸癌患者生活質量，延長生存期，降低患者放化療治療的毒副作用，具有減毒增效之優勢[11]。郭志強教授認為應在感受濕熱之邪早期針對宮頸HPV感染治以清熱利濕，解毒殺蟲，并選用清熱利濕法，并創立了紫草散，全方以紫草為君藥，以金銀花、苦參、黃柏、莪術為臣藥，佐以白及、百部及冰片，以兒茶為使[12]。前期研究表明紫柏凝膠具有抑制宮頸癌Siha細胞增值，促進癌細胞凋亡的作用[13]。然而其抑癌的具體機制尚不明確，并未得到更進一步的闡明。

研究證實，HR-HPV基因由3個部分組成：早期區，晚期區，長控制區。早期區(Early region，E)含E1至E7共6個基因，HR-HPV其致癌機理主要與 E6、E7 蛋白有關。 E7 與成視網膜細胞瘤(Rb)腫瘤抑制蛋白結合，導致蛋白降解；而E6 與 p53 結合，促進細胞增殖，減少細胞凋亡[14]。ERK及p38參與了細胞的生長、發育等生理過程。ERK及p38 是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)在細胞惡性轉化過程中起著關鍵性作用，ERK及p38信號通路的研究對腫瘤防治工作有重要意義[15]。

本研究采用動物實驗方法，通過建立Siha(+)宮頸癌荷瘤裸鼠模型，研究各劑量組紫柏凝膠治療宮頸癌療效及優勢，陰性對照組選用模型組，陽性對照組選用順鉑組，研究結果顯示紫柏凝膠各組對宮頸癌荷瘤裸鼠移植瘤的生長均有不同程度的抑制作用。高、中、低劑量組的腫瘤抑制率分別為36.23%、31.24%及14.94%。研究結果表明：紫柏凝膠可下調致癌蛋白E6和E7的表達，同時阻斷ERK及p38/MAPK信號通路，下調p-ERK、p-p38蛋白的表達。ERK及P38/MAPK信號通路未必是紫柏凝膠抑制腫瘤、影響癌蛋白表達的全部內容，此過程還有哪些通路的參與尚需進一步實驗研究證明。