大麥條紋病原菌的RAPD遺傳多樣性分析及大麥親本抗性評價

侯靜靜，何智宏，司二靜，姚立蓉，汪軍成，馬占軍，李葆春，4，楊 軻，孟亞雄，馬小樂，王化俊

（1.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室／甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，蘭州 730070；2.甘肅農業大學 農學院，蘭州 730070；3.甘肅省林業科技推廣總站，蘭州 730046；4.甘肅農業大學 生命科學技術學院，蘭州 730070）

大麥（Hordeum vulgare L.）是禾本科大麥屬1a生草本植物，啤酒大麥是甘肅省優勢特色產業［1］。大麥條紋病（Barley leaf stripe）是大麥的主要病害之一，在大麥種植區普遍發生［2-3］。國際范圍內在地中海和北歐地區發病較為嚴重［4-5］。中國長江流域的滬、贛、浙、湘等地發病較重，病株死亡率高達30%～40%［6］。甘肅啤酒大麥和青稞的種植地同樣發生該病害，發病嚴重時能造成10%～30%的減產［7］。由于耕作制度的變化以及多年的連茬種植，該病害發生日趨嚴重，對于該病原菌抗性研究顯得尤為重要。現已得知，該病是由種子帶菌引起的系統侵染性真菌病害，其病原菌的無性階段為禾內臍蠕孢（Drechslera graminea（Rabenh &Schlecht）Schoemaker）［8］，有性階段為麥類核菌（Pyrenophora graminea）［9］。

運用分子標記技術研究該病原菌的遺傳差異性，可以對大麥條紋病防治與抗性育種方面提供理論依據。分子標記技術包括許多類型，如IRAP、RAPD、RFLP、AFLP、SSR 等［10］。其 中RAPD（random amplified polymorphic DNA）技術是通過PCR（Polymerase Chain Reaction）擴增產物片段的多態性來揭示待測基因組DNA 的遺傳多態性［11］。該技術的引物為隨機多態單引物，且與模板配對穩定，其操作方便快捷，退火溫度低等特點極大地提高了分析效率［12］。Jawhar等［13］對敘利亞地區不同地理來源的麥類核菌（P.graminea）進行RAPD 遺傳多態性分析，結果得出不同地理來源菌株之間有明顯差異性，表明RAPD可快捷準確地檢測病原菌遺傳多樣性。Zein等［14］運用IRAP和ITS-RFLP 2種標記方法分析麥類核菌（P.graminea）的遺傳多樣性，得出2種標記方式均能很好地揭示多樣性。Bayraktar等［15］研究表明，運用ISSR 分析可將供試的麥類核菌（P.graminea）菌株劃分為4 個簇，用ITSRFLP分析結果顯示菌株間無差異。在大麥條紋病抗性評價研究方面，Mueller等［16］在德國薩克森聯邦州對620份大麥品種進行大麥條紋病的抗性鑒定，結果得出，超過186份品種在田間表現為抗性。

甘肅省的大麥種植區域廣泛，河西走廊地區的生態環境多樣，大麥條紋病原菌在該地區的遺傳多樣性及大麥親本對該病菌的抗性尚未明確。因此本研究以河西地區的麥類核菌（P.gra-minea）為研究對象，運用RAPD 分子標記技術進行遺傳多態性分析，采用“夾心法”鑒定大麥親本材料對其抗性［17］，以期為大麥條紋病病害的防控和抗性育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 20 個供試菌株于2009 和2012年采自河西走廊啤酒大麥種植區域，均采集于大麥條紋病發病植株的葉片部位，由甘肅農業大學麥類課題組保存并進行致病機理的研究。供試菌株信息如表1所示。

1.1.2 供試大麥品種 抗性評價的30份大麥品種由甘肅省干旱生境作物學重點實驗室／甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室提供，來自國內外不同大麥產區。

1.1.3 培養基的配制 使用的培養基為馬鈴薯葡 萄 糖 瓊 脂 培 養 基（Potato Dextrose Agar，PDA），將新鮮馬鈴薯削皮去芽眼切成1cm2的小方塊，稱取重量200g，加1L蒸餾水煮沸20min，過濾去殘渣，在濾液中加入20g葡萄糖和17g瓊脂，玻璃棒攪拌混勻，加蒸餾水定容至1L，高壓蒸汽滅菌。

表1 供試菌株信息Table 1 Information of Pyrenophora graminea

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株遺傳多樣性的RAPD 分析 參照真菌基因組DNA 提取方法來提取20 個供試麥類核菌（P.graminea）菌株基因組DNA［18］。用超微量分光光度計測定其OD230／OD260值，OD260／OD280值和濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，最終置于-20 ℃冰箱保存，備用。由華大基因公司（BGI）合成隨機多態單引物［13，19］。

RAPD 擴增體系優化試驗的引物為OPK3（序列：5′-CCAGCTTAGG-3′），DNA 模板為菌株SD，將 DNA 模 板 濃 度、2 × MasterMix（BIOTEKE，PR1701）添加量和循環數分別設置兩個水平，30ng／μL和60ng／μL，5μL 和7μL，40和45（表2），PCR 反應程序如表3所示。擴增產物經GoldView Ⅱ（GV Ⅱ）染色，1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外光凝膠成像系統顯像，拍照。

表2 RAPD優化設置Table 2 Optimal setting of RAPD

表3 擴增程序Table 3 PCR program

運用篩選出的多態單引物和優化后的擴增體系對20 個供試菌株基因組DNA 進行RAPDPCR 擴增和DNA 指紋圖譜分析，將電泳結果DNA 圖譜中的無條帶DNA 記為0，有條帶記為1，建立0，1型二元矩陣。各菌株間遺傳相似性系數（Genetic Similarity，GS）的計算采用軟件NTSYSpc 2.10e 完 成［20］，聚 類 分 析 圖 的 構 建 采 用UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean）法［21］。

1.2.2 大麥親本抗性評價 采用“夾心法”，以實驗室前期鑒定出的大麥條紋病強致病性菌株QWC來接種侵染30 份供試大麥親本材料［22］。首先進行大麥種子預處理，將種子置于200 mL錐形瓶，加入φ=70%酒精震蕩30s，移除上清，加入無菌水，震蕩后吸除，重復3次，再加入φ=5%次氯酸鈉震蕩5min，除上清，加入無菌水，震蕩去上清，重復3次，然后將種子置于無菌濾紙上吸干水分，接著將處理后的種子放置于PDA 菌絲平板上，最后，在種子上層覆蓋一層同樣的PDA 菌絲平板，菌絲面接觸種子。

試驗以大麥種子置于空白PDA 平板培養基間作為對照，每個大麥品種設置30粒種子。4 ℃黑暗生化培養箱中侵染生長20d，然后移栽至花盆中。培養條件為12h（光照）／12h（黑暗），溫度為20℃（光照）／12℃（黑暗），濕度為40%的環境中生長。觀察大麥發病情況，統計感病率。參考Pecchioni等［23］方法進行大麥條紋病抗性等級評價：高感（HS）：感病率＞40%；感病（S）：感病率15%～40%；抗病（R）：感病率5%～15%；高抗（HR）：感病率＜5%；免疫（I）：感病率=0%。

2 結果與分析

2.1 RAPD 擴增體系優化

如圖1所示，在10μL的反應體系中，當變量僅為DNA 模板濃度時，30ng／μL和60ng／μL兩個水平的擴增結果無顯著差異，如1和2，3和4，5和6，7和8號泳道兩兩對比所得；當變量為擴增循環數時，40和45的擴增結果同樣差異不明顯，如1和5，2和6，3和7，4和8號泳道兩兩對比所示；但是5μL 和7μL 的2×MasterMix對擴增結果有較大差異，泳道1和3，2和4，5和7，6和8號兩兩對比可以看出，5μL較7μL的擴增條帶清晰，且在1 000bp到2 000bp間多出兩條條帶。鑒于此，本試驗的RAPD-PCR 擴增反應體系為：1μL 引物（10μmol／L），1μL DNA 模板（30ng／μL），5μL的2×MasterMix（BIOTEKE，PR1701），加ddH2O 至10μL。PCR 反應循環參數如表3 所示。擴增產物經GoldView Ⅱ（GVⅡ）染色，1%瓊脂糖凝膠電泳分離，拍照。

圖1 PCR 體系優化的擴增結果Fig.1 Amplification results of optimized PCR system

2.2 RAPD圖譜和聚類分析

篩選出30對具有多態性且條帶清晰的隨機單引物（表4）進行RAPD-PCR 試驗，共獲得63條多態性條帶，總條帶數為138條，多態性條帶數占總條帶數的45.65%。其中引物S2082，S61，S9，S6和S1的多態性比率均為100%，引物S82的多態性比率最小，為12.50%。

表4 RAPD分析引物序列和多態性條帶Table 4 Sequence of primers and number of polymorphic fragments obtained by RAPD analysis

采用UPGMA 法構建分子系統發育樹，結果顯示（圖2）：菌株HZ 和QWC、菌株QQ 和SW之間的遺傳相似系數（GS）均為0.936 5，為20個供試菌株間遺傳相似性最高，且它們地理位置各不相同，分別在武威市、蘭州市、張掖市和金昌市，其次是來自金昌市的菌株SSB和CJZ間的GS為0.921 6。菌株YC 的遺傳相似性系數（GS）為0.624 1，采自金昌市永昌縣，在供試菌株間最小，與其余19個菌株間的遺傳差異較大，次之是武威市黃羊河鎮的菌株HYH，遺傳相似性系數（GS）為0.674 1。供試的20 個不同地區麥類核菌（P.graminea）間的遺傳相似系數（GS）范圍為0.624 1～0.936 5，在遺傳相似系數為0.716 6時可將20個菌株劃分為4類，菌株XTB和JT 為一類，且這兩個菌株的地理位置相隔較遠，前者在張掖市，后者在白銀市，GS最小的菌株YC 單獨為一類，次小的菌株HYH 獨自為一類，剩余16個菌株聚為一類，其中，菌株TB 與其他15個菌株差異較大，GS 為0.748 1 時菌株SS、CH、SD、GL、DQ、QZ和SSS聚在一起，剩余8個菌株聚在一起。綜上可得不同地理來源的麥類核菌（P.graminea）菌株間存有一定的遺傳差異性。

如圖3所示，試驗中20個菌株間遺傳距離為0.052 3～0.819 1，圖中數值與對角相應的方格顏色相一致。可以看出，菌株TB 和YC 間的遺傳距離最大，對應方格顏色為深藍色，說明這兩個不同地理位置菌株之間的親緣關系最遠，分別采自武威市頭壩村和金昌市永昌縣。菌株QQ 和菌株SW 的遺傳距離最小，對應方格顏色為深紅色，說明兩菌株親緣關系最近，遺傳差異較小，采自張掖市清泉鎮和金昌市雙灣鎮。在供試的20個不同地區菌株中，菌株SW 和QWC，菌株HZZ 和SW，菌株SSB 和HZ 之間的地理位置均相隔較遠，但遺傳距離均較小，僅有0.069 9、0.065 3和0.088 0。菌株JT 和SSS，菌株YC 和XSB 的地理位置較接近，但遺傳距離較大，分別為0.438 3和0.633 0。同時也存在地理位置接近遺傳距離小和地理位置遠遺傳距離大的菌株，例如菌株CJZ和SW，菌株XTB 和YC，遺傳距離分別為0.078 0和0.607 9，得出地理位置間的遠近差異與菌株遺傳距離的大小無顯著相關性。

圖2 基于RAPD分析的20個菌株間遺傳相似系數的UPGMA法聚類圖Fig.2 Phylogenetic tree constructed by UPGMA of similarity index matrix among 20tested isolates based on RAPD analysis

圖3 基于RAPD分析的20個菌株之間的遺傳距離Fig.3 Ggenetic distance of 20strains based on RAPD markers

2.3 大麥親本抗性評價

用甘肅農業大學農學院麥類實驗室前期篩選到的強致病性麥類核菌（P.graminea）菌株QWC對30個大麥材料進行苗期抗大麥條紋病鑒定（表5）［22］。試驗未篩選出免疫（I）及高抗品種（HR），篩選得到抗病品種（R）為5 個，分別為‘J04970’‘Z200V038V’‘Z1450008W’‘Z1’和‘甘啤6 號’，均具有一定的抗病能力，感病率為5%～15%，在30份供試品種中占到16.67%；品種 ‘P002-3’‘2039040Q’‘TRADITION’‘Z040P111Q’‘Isotta’和‘Z02751407’的感病率均＞40%，屬于高感品種（HS），占供試品種數的20%；其余19個感病品種（S）的感病率不盡相同，抗大麥條紋病能力存在一定差異性，感病率介于15%～40%。在供試的30份大麥親本材料中，抗病性結果表現出較大差異，品種‘甘啤6號’感病率為10.84%，對菌株QWC 的抗性最好，品種 ‘Isotta’的抗病能力最差，感病率達到73.53%。

表5 大麥親本抗性鑒定Table 5 Resistant identification of barley varieties

3 討論與結論

3.1 不同地理位置菌株遺傳多樣性分析

Jawhar等［13］和 鄭 果［24］采 用RAPD 分 子 標記技術研究麥類核菌（P.graminea）菌株的遺傳多樣性時，篩選到的RAPD 多態性引物分別只有2條和9 條，本試驗篩選出30 對多態性引物，RAPD 引物篩選的越多，不同地理位置麥類核菌的遺傳差異性表現越明顯。在Bakonyi等［25］的相關研究中，遺傳相似系數（GS）為0.868 0～0.976 0，本試驗中GS為0.624 1～0.936 5，與之相比范圍更廣，更好地揭示了麥類核菌（P.graminea）菌株間遺傳差異性。

通過優化后的RAPD 擴增體系進行試驗，共獲得63條多態性條帶。在遺傳相似系數（GS）為0.716 6時將供試的20個菌株劃分為4類，其中菌株HZ和QWC、菌株QQ 和SW 之間的遺傳相似系數（GS）均為0.936 5，20個供試菌株間遺傳相似性最高，且它們地理位置各不相同，但共同聚為一類。菌株SW 和QWC，菌株HZZ和SW，菌株SSB和HZ之間的地理位置均相隔較遠，但遺傳距離均較小，僅有0.069 9、0.065 3和0.088 0。同時也存在地理位置接近遺傳距離小和地理位置遠遺傳距離大的菌株，例如菌株CJZ和SW，菌株XTB和YC。因此得出不同地區所分離的麥類核菌菌株間親緣關系的遠近與地理差異無明顯相關性，與司二靜等［22］運用ISSR 方法分析結果相一致。李登輝等利用8 對AFLP 選擇性引物組合對19份麥類核菌進行多態性擴增，試驗菌株劃分為4個類群，相似系數（GS）為0.83，同樣得出菌株間遺傳距離的遠近與其地理分布無明顯規律［26］。

綜合RAPD 分析結果得出甘肅河西地區麥類核菌菌株間有較大遺傳差異，但菌株遺傳特性與地理分布區域無明顯相關性。菌株間之所以存在較大遺傳差異，推測可能與河西不同地區的海拔、光照、溫度、濕度等環境因素造成的遺傳變異有關。條紋病菌株遺傳特性與地理位置無明顯相關性，可能與大麥條紋病的是種傳病害的特性有關，其病原菌-麥類核菌（P.graminea）的菌絲不存在胚中，它在果皮薄壁細胞之間的種子中存活，在果殼和種皮中生長［27-28］，不同地理位置所分離的麥類核菌聚為一類的原因可能是種子帶菌傳播所致。

3.2 大麥親本抗性評價

本試驗采用強致病性菌株QWC 鑒定30 個大麥品種的苗期抗病性，結果表明，同一麥類核菌（P.graminea）菌株侵染不同大麥親本材料，大麥條紋病抗性差異較大，與Bayraktar等［15］的相關研究結果相似。本研究中，鑒定篩選出6份高感品種、19份感病品種和5 份抗病品種，抗大麥條紋病品種分別為‘1J04970’‘甘啤6 號’‘Z200V038V’‘Z1450008W’和‘Z1’。所有供試材料中，‘甘啤6 號’感病率為10.84%，對菌株QWC 的抗性最好，‘Isotta’的抗病能力最差，感病率達到73.53%，共同組成大麥條紋病的抗感組合。Mueller等［16］采用自然侵染和“夾心法”侵染兩種方式鑒定610份大麥材料的大麥條紋病抗性，發 現 品 種‘HOR 333’‘HOR 11475’‘OU J362’和‘BGRC 5592’在兩種方式中都顯示出抗性。吳寬然［29］鑒定115份大麥品種的抗性，得到抗性品種31 份、中抗24 份、中感54 份、高感7份，其中二棱品種的平均感病率較六棱品種高。張萬霞等［30］鑒定191份大麥材料，抗條紋病品種89份，其中‘單2’‘單6’和‘Harrington’農藝性狀優良，具有較好的利用前景。孫立軍等［31］篩選優異大麥種質資源，發現國內‘豫大麥1號’‘東陽三月黃’‘烏米大麥’等品種，國外‘Konal’‘ZF2262’‘崗12’等品種對大麥條紋病都具有良好抗性。本試驗未篩選到免疫及高抗品種，可能由于試驗品種數量較少，菌株類型單一，后期將選擇較多大麥品種材料和強致病性菌株進行抗性鑒定，篩選出更加優良的大麥條紋病抗感品種組合，為大麥條紋病病害的防控，抗性育種及病原菌研究奠定基礎。