菊芋查爾酮合成酶基因的克隆與表達分析

李文靜，孫艷香，付亞娟，蘇彥蘋，王聰艷，侯曉強，張新業

（1.廊坊師范學院 生命科學學院，河北廊坊 065000；2.河北省動物多樣性重點實驗室，河北廊坊 065000；3.廊坊市細胞工程與應用研究重點實驗室，河北廊坊 065000）

類黃酮（又稱黃酮類化合物）是植物中廣泛存在的一類具有重要生物功能的次級代謝產物，種類繁多，且生理作用廣泛［1］。類黃酮合成通過苯丙醇和聚酮途徑，起始階段為1分子香豆酰輔酶A 和3分子丙二酰輔酶A（malonyl-CoA）縮合形成柚皮素查爾酮（naringenin chalcone），該產物經過多步酶促反應生成類黃酮和花青素［2-4］。查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）屬于III型聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS），是植物聚酮合酶超家族中最具代表性的一員，是黃酮／類黃酮合成過程中的第一個關鍵酶、限速酶。1983年首次從歐芹細胞懸浮培養物中獲得CHS 基因的cDNA 序列，此后多種植物中的CHS 基因陸續被克隆［5-6］。CHS參與植物生長發育，此外CHS基因在脅迫條件下能夠被誘導表達，引起黃酮和植保素的聚集，從而參與水楊酸防御途徑［7］。不同物種的CHS 基因序列較為保守，多數基因含有2個外顯子和1個內含子；內含子存在位置相對保守，但其長度在不同的物種間變化較大；第1外顯子通常編碼37～64個氨基酸殘基，第2外顯子大約編碼340個氨基酸殘基，且第2外顯子較第1外顯子具有更高的保守性，編碼了幾乎所有的活性位點［8］。

菊芋為菊科（Asteraceae）向日葵屬（Helianthus）多年生草本植物，原產于北美，17世紀傳入歐洲，由于其耐寒耐旱，適應性強，現已引種到世界許多國家和地區［9-10］。由于菊芋對于改良鹽堿土地、修復油田污染土地以及煤礦開采方面具有重要作用，近年來在山西、黑龍江、山東、江蘇等省規模種植，且已經取得顯著的經濟、生態和社會效益［11］。菊芋用途廣泛，塊莖中含有豐富的糖分和菊粉，可供食用，地上部分莖稈可作動物飼料［12］；菊芋在抗菌、調節腸道功能、抗腫瘤等方面也具有一定的藥用價值［13］；此外，菊芋還可作為生物燃料和造紙工業的原料［14-15］。菊芋中黃酮類物質含量較豐富，尤其是在葉片中，這對于菊芋的抗氧化活性至關重要［16］。目前對菊芋的研究主要集中在品 種 選 育［17-19］、栽 培 引 種［20］、菊 糖 提 取 工 藝 優化［21］及非生物脅迫等方面［22］，關于菊芋中類黃酮代謝途徑基因克隆鮮見報道。

鑒于CHS 在類黃酮合成途徑中的重要作用，本研究擬以菊芋為材料，根據同源克隆，獲得HtCHS 基因序列，設計引物分別對其DNA 和cDNA 序列進行擴增，通過克隆、測序及比對，獲得其基因結構；通過生物信息學分析，預測其編碼蛋白的理化性質、高級結構和系統進化地位；通過實時熒光定量PCR 技術分析其組織表達部位和誘導表達情況；構建原核表達載體pET-28acHtCHS并進行原核誘導表達。該研究可為后續利用該基因調控菊芋黃酮類成分的生物合成，實現優質高產的菊芋品種選育研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗采用的菊芋‘廊芋8號’種植于河北省廊坊市思科農業技術有限公司育種基地，采集其根、莖、葉片及塊莖，液氮速凍，用于組織表達模式分析。取苗期菊芋，分別置于水、20%PEG 6000和150mmol·L-1NaCl中脅迫處理0、6、12、24 h，總計12個處理，每個處理3個重復，取葉片液氮速凍，用于誘導表達分析。大腸桿菌（Escherichia coli T.Escherich）菌株Tran10 和BL21（DE3）購自北京全式金生物公司；pET-28a載體由植物分子遺傳學實驗室保存；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒DNA 提取試劑盒、RNAprep pure試劑盒購自天根生物技術有限公司；DNA提取試劑盒購自艾德萊公司；GoScriptTMReverse Transcription System 購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司；Taq DNA 聚合酶、限制性內切酶、卡那霉素、IPTG 均購自大連寶生物公司（TaKaRa）；Ligtaion high購自東洋紡公司；引物合成和基因測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.2 菊芋總RNA提取及cDNA 的合成

菊芋不同組織部位及不同處理材料總RNA提取采用RNAprep pure試劑盒，利用DNaseI去除基因組后，經10g／L 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完 整 性、NanoDrop 2000c檢 測RNA 濃 度和純度；之后使用RNA 進行第一鏈cDNA 合成，按 照GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒說明書進行，―20 ℃保存，備用。

1.3 菊芋基因組DNA 提取

參照艾德萊CTAB植物基因組DNA 快速提取試劑盒說明書提取菊芋葉片DNA，利用RNase去除RNA 后，經10g／L瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000c對DNA 完整性、濃度和純度進行檢測。

1.4 HtCHS 基因cDNA及gDNA序列的克隆

根據GenBank中收錄的向日葵、野菊花、甘菊、菜薊、紫背天葵菜CHS 基因序列及原核表達載體pET-28a多克隆位點，設計1對含有酶切位點引物CHS7peF 和CHS7peR（表1）。分別以cDNA 和gDNA 為 模 板 進 行PCR 擴 增，反 應 程序采用降落PCR（touch down PCR），95 ℃預變性5min；95 ℃變性30s，65～55 ℃退火30s（每個循環降1 ℃），72 ℃延伸50s，10個循環；95 ℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30個循環；72 ℃延伸5min。10g／L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化回收目的片段，并連接pTOPO 平末端載體，經酶切鑒定，得到重組質粒pTOPO-BcHtCHS和pTOPO-B-gHtCHS，送測序。

1.5 HtCHS 基因結構分析

將測序獲得的gDNA 和cDNA 序列提交https：／／www.ebi.ac.uk／Tools／msa／clustalo／網站進行比對，確定外顯子、內含子位置及個數。

1.6 HtCHS的生物信息學分析

利 用ExPASy ProtParam tool 工 具 預 測HtCHS編碼氨基酸的相對分子質量、等電點（pI）及疏水性；利用Signal P 3.0Server進行信號肽預測；利用TMHMM Server 2.0 進行蛋白跨膜區預 測；利 用NCBI 網 站 上 的CDD（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure／cdd／wrpsb.cgi）分析HtCHS蛋白保守域。利用PredictProtein方法和SWISS-MODEL 軟件預測其二級和三級結構。在NCBI數據庫中檢索與HtCHS同源性較高的同源序列，并下載相似性較高的10種植物的CHS序列，利用Culstal Omega（https：／／www.ebi.ac.uk／Tools／msa／clustalo／）和Genedoc（http：／／www.ch.embnet.org／software／BOX＿form.html）進行多重序列比對。然后用MEGA 6.0進行系統發育分析（Maximum Likelihood Tree，Bootstrap 1 000次重復檢驗各分支的置信度），分支處的數字表示該分支分析的可靠程度，數值越大，可信度越高。

1.7 HtCHS 重組質粒的獲得與鑒定

將pTOPO-B-cHtCHS 和pET-28a 分 別 使用EcoRⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，10g／L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化目的基因片段和pET-28a載體骨架。回收產物利用Ligation high進行連接，轉化大腸桿菌Tran10 感受態細胞，選取陽性克隆，提取質粒，進行雙酶切鑒定，正確的送美吉公司測序，獲得的重組原核表達載體命名為pET-28a-cHtCHS。

1.8 HtCHS 基因在大腸桿菌中的誘導表達

利用熱激法將重組質粒pET-28a-cHtCHS轉化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，陽性克隆過夜搖菌，次日按1∶100的比例轉接到新鮮的LB培養基中，37 ℃培養至OD600值達到0.6左右，加入IPTG 至終濃度0.5 mmol·L-1，37 ℃分別誘導0、1、2 和4h，取200μL 菌液，12 000 r·min-1離心收集菌體，加入40μL 5×SDSPAGE蛋白上樣緩沖液，混勻后100 ℃加熱10 min，12 000r·min-1離心2min，取10μL上清液上樣進行SDS-PAGE（5%濃縮膠和12.5%分離膠）電泳檢測。

1.9 HtCHS 的組織特異性及脅迫誘導分析

根據HtCHS 基因和內參基因序列，應用Primer 5.0軟件設計實時熒光定量RT-PCR 引物，信息見表1，內參基因為菊芋26SrRNA（Gen-Bank登錄號KT179742.1）［23］。采用實時熒光定量PCR 檢測系統分析HtCHS 相對表達量。實時定量RT-PCR 反應體系為25μL，具體參照2×Sybr Green qPCR Mix（Low ROX）說明書。實時定 量RT-PCR 程 序 為95 ℃、3 min；95 ℃、10s；63℃、10s；72℃、20s；40個循環；最后設置溶解曲線分析程序。試驗設置3次技術重復，采用2-ΔΔCt法計算不同組織表達部位、不同處理及對照樣品中的表達量。采用SPSS 13.0進行差異顯著性分析。

表1 研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

2 結果與分析

2.1 HtCHS 基因開放閱讀框（ORF）的克隆

根據向日葵CHS 同源序列，從菊芋葉片中，RT-PCR 擴增HtCHS 基 因，得到一條1 197bp基因片段（圖1，小條帶測序結果表明為非特異性擴增）。將PCR 產物與pTOPO 平末端載體進行連接，轉化，選取陽性克隆進行菌落PCR 擴增，得到一條與ORF 全長大小一致的片段（圖2）。進一步對重組質粒進行雙酶切驗證，酶切獲得1 865bp載體片段和1 197bp基因片段（圖3）。綜上所述，HtCHS（登錄號為MN124515）編碼398個氨基酸，成功獲得重組質粒pTOPO-BcHtCHS。以DNA 為模板，使用CHS7peF 和CHS7peR 引物進行PCR 擴增，獲得全長1 567 bp DNA 片段，包括一個大小為370bp 的內含子。gDNA 和cDNA 擴增電泳圖和內含子位置見圖1和圖4。

圖1 HtCHS 基因的PCR 與RT-PCR擴增產物Fig.1 PCR and RT-PCR products of HtCHS

圖2 pTOPO-B-cHtCHS菌液PCR 產物檢測Fig.2 Clonal PCR detection of pTOPO-B-cHtCHS

圖3 pTOPO-B-cHtCHS載體雙酶切鑒定圖Fig.3 Digestive detection of pTOPO-B-cHtCHS plasmid

2.2 HtCHS的生物信息學分析

2.2.1 HtCHS蛋白質序列分析 利用ExPASy ProtParam （https：／／web.expasy.org／protparam／）在線分析HtCHS蛋白的序列組成和理化性質。HtCHS相對分子質量為43 601.44，pI為6.33，分子式為C1938H3097N521O573S23，半衰期為30h。不穩定指數為38.66，脂肪族指數為88.97，總平均疏水性為-0.071。該蛋白由20種氨基酸組成，含量最高的3 位分別是亮氨酸（9.5%）、甘氨 酸（9.3%）和 谷 氨 酸（7.8%）（圖5）。HtCHS 蛋白保守結構域預測表明HtCHS氨基酸序列中含有查爾酮合成酶保守結構域，屬于查爾酮合成酶超家族成員（圖6）。信號肽預測結果表明HtCHS 序列中無明顯的信號肽序列；蛋白跨膜區預測結果表明HtCHS無典型的跨膜區，屬于非分泌蛋白；二級結構預測結果表明該蛋白α-螺旋（H）占40.45%，延伸鏈占10.05%，無規卷曲（C）占49.5%。利用Swiss-Model Workspace以6dxb.1為模板預測HtCHS蛋白的三級結構，與擬南芥查爾酮合成酶基因編碼蛋白序列一致性為85.17%，全局模型質量評估值為95%，說明該預測結果準確（圖7），且與二級結構預測結果一致。

圖5 HtCHS氨基酸組成Fig.5 Amino acid composition of HtCHS

圖6 HtCHS蛋白保守域分析Fig.6 Prediction of the conserved domain in HtCHS

2.2.2 氨基酸序列同源性分析 經Clustal Omega比對分析，菊芋HtCHS蛋白序列與其他植物的CHS序列具有較高相似性（圖8）。圖8中不同灰度代表HtCHS 氨基酸與其他植物中CHS氨基酸的同源程度，黑色區域代表同源程度高達100%。菊芋CHS（MN124515）氨基酸序列保守性極強，與向日葵（Helianthus annuus，XP＿022009667.1）、松 果 菊（Echinacea pallida，APO10381.1 ）、大 麗 菊（Dahlia pinnata，BAJ14519.1）、萵 苣（Lactuca sativa，XP ＿023735557.1）、熊 膽 草（Eschenbachia blinii，AHN85848.1）、菊花（Chrysanthemum x morifolium，ABF69124.1）、北 野 菊（Chrysanthemum boreale，AGU91424.1）、山 茱 萸 變 種（Cynara cardunculus var.Scolymus，XP＿024970907.1）、紫背 菜（Gynura bicolor，BAJ17656.1）、青 蒿（Artemisia annua，PWA65027.1）的CHS 蛋白質 的相似度分別為99.25%、96.48%、93.97%、93.22%、93.47%、92.95%、92.46%、91.46%、92.21%和91.96%，其保守性可能與其在植物體內的功能有關。最大似然法系統發育分析顯示，菊芋CHS蛋白與向日葵聚在一個分支，與其他物種（松果菊、大麗菊、萵苣、熊膽草、菊花、北野菊、山茱萸變種、紫背菜、青蒿）CHS 蛋白未聚在一個分支，親緣關系均較遠（圖9）。

圖7 HtCHS蛋白三級結構預測Fig.7 3Dstructure prediction of the HtCHS protein

圖8 HtCHS與其他植物中CHS氨基酸序列的同源性Fig.8 Multiple sequence alignment of HtCHS with CHS from other plants indicated

圖9 HtCHS與相關物種CHS蛋白的系統發育分析Fig.9 Phylogentic analysis of HtCHS and relative CHS proteins

2.3 HtCHS蛋白的原核表達

2.3.1 HtCHS 基因原核表達載體的構建 將pTOPO-B-cHtCHS與原核表達載體pET-28a進行酶切連接，通過EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定（圖10）及測序，將正確的克隆轉入感受態細胞BL21（DE3）中。

2.3.2 將pET-28a-cHtCHS 轉入表達菌株BL21（DE3）中進行原核表達 菌落PCR 檢測含有重組質粒pET-28a-cHtCHS的BL21（DE3）菌落，在0.5 mmol·L-1IPTG 條件下，37 ℃分別誘導0、1、2、4h，如圖11所示，pET-28a-cHtCHS經誘導后獲得一條與預期蛋白一致（43.61ku）的特異性條帶。蛋白表達量隨誘導時間的增加而增多，在4h 時達到最高水平（圖11）。結果表明pET-28a-cHtCHS載體構建成功，并通過IPTG誘導成功獲得了目的蛋白。

圖10 pET-28a-cHtCHS雙酶切檢測Fig.10 Digestive detection of pET-28a-cHtCHS plasmid

圖11 原核表達HtCHS的SDS-PAGE電泳檢測Fig.11 SDS-PAGE analyses of the recombinant HtCHS protein

2.4 HtCHS 表達分析

應用實時定量RT-PCR 分析HtCHS 基因在菊芋不同組織和葉片經干旱、高鹽處理之后的表達情況。結果表明，HtCHS 在根中表達量最高，其次是塊莖、莖和葉片（圖12）。與對照相比，150mmol·L-1NaCl和20%PEG6000處理6h時HtCHS 表達顯著上調（P＜0.05），處理12h時顯著下降（P＜0.05），處理24h 時，表達量無顯著差異（圖13）。

圖12 HtCHS 在菊芋不同組織部位的表達Fig.12 Expression of HtCHSin different tissues of Helianthus tuberosus

圖13 不同脅迫條件下葉片HtCHS 基因表達Fig.13 Expression of HtCHSin leaves under different stress

3 討 論

查爾酮合成酶是調控次生代謝產物類黃酮合成的關鍵酶，能夠催化香豆酰輔酶A 和丙二酰輔酶A 生成柚皮素查爾酮。該產物在其他酶的協同作用下合成一系列黃酮類化合物。植物體內黃酮類物質的積累與查爾酮合成酶的活性及表達量相關，提高CHS 基因的表達量可以增加菊芋體內黃酮類物質的積累量。因此，克隆菊芋CHS基因并分析其在不同組織、不同脅迫處理條件下的表達量水平有望在分子水平上調控黃酮物質的合成。

CHS廣泛存在于各種植物中，目前各物種中均可分離到數量不同的CHS 基因［24］。本研究成功克隆到HtCHS 基因的ORF及基因組序列，基因結構分析表明該基因含有2個外顯子和1個內含子，第一外顯子編碼62個氨基酸殘基，與之前報道結果相吻合［15］。CHS 在不同物種間的基因序列長度差異較小，同源性較高，蛋白序列高度保守［25］。王旭等［26］對比黃秋葵與其他植物CHS序列的同源性，發現黃秋葵與黃蜀葵、掌葉槭、山茶、蝶豆、陸地棉、草莓CHS 序列同源性均達90%以上，其中與黃秋葵同源性最高為99.23%。本研究得到的菊芋CHS序列與其他植物的CHS序列相似性極高，與同屬向日葵（XP＿022009667.1）的同源性高達99.25%，表明其確為CHS 基因，推測HtCHS與它們亦有相似的功能，對類黃酮合成至關重要。系統進化樹分析表明HtCHS蛋白與向日葵CHS 聚于一個分支，物種間系統發育關系與已知的分類學地位相符合。跨膜結構域預測表明該蛋白無跨膜區，為可溶性蛋白。同時對HtCHS 基因進行原核表達，為后續的蛋白純化、體外酶學分析、蛋白結晶解析等奠定了理論基礎。為了進一步驗證菊芋查爾酮合成酶是否具有活性，將進行植物表達載體構建，侵染擬南芥查爾酮合成酶缺失突變體tt4，觀察其是否能夠回復該酶缺失的表型。

CHS 基因家族是由8～10個成員組成的多基因家族，CHS 基因在植物不同部位的表達特性有所不同［27］。本研究分析了菊芋不同器官中HtCHS 基因的mRNA 表達水平，該基因在根、葉、莖、塊莖中均有表達，在根中表達量最高，這與黃芩中CHS 基因表達模式一致［28］。使用150 mmol·L-1NaCl和20%PEG 6000處理苗期菊芋后，HtCHS 表達水平立即增加，在處理后6h達到對照水平的13.57 倍和18.42 倍，隨之在12h分別下降至4.78倍和3.34倍，處理后24h與對照相比均無明顯變化。這表明HtCHS 參與鹽脅迫和干旱響應。人參CHS1 參與 水楊酸、茉莉酸甲酯介導的防御反應，但是對脫落酸和NaCl 處 理 沒 有 產 生 明 顯 反 應 不 一 致［29］。HtCHS 參與鹽脅迫和干旱反應結果與人參CHS1 不參與鹽脅迫結果不同，有可能與CHS為一基因家族，菊芋與人參克隆的不是同一基因，或者進行脅迫處理時菊芋選擇葉片作為材料，而人參選擇發根作為材料有關。

近年來菊芋備受關注，但由于其為六倍體，基因組測序困難，目前尚無公開的基因組序列，無法通過生物信息學手段分析菊芋基因組中具體存在多少個查爾酮合成酶編碼基因；雖然筆者在擴增時候發現有非特異性條帶出現，將其測序之后發現非特異性條帶并不是查爾酮合成酶基因序列。本研究成功從菊芋葉片中克隆了HtCHS，對其進行生物信息學、組織特異性表達及脅迫誘導表達分析，并構建原核表達載體，成功誘導表達了該蛋白，對進一步實現菊芋及類似以類黃酮為主要活性成分植物的遺傳改良、品質改善具有十分重要的理論意義和實踐價值。下一步將純化HtCHS 蛋白，進行體外酶活檢測，同時構建HtCHS 基因的植物表達載體并進行模式植物的遺傳轉化，驗證該基因功能，以期從分子水平上揭示HtCHS 基因表達與黃酮含量的關系。