酸脅迫和冷脅迫對鼠李糖乳桿菌的交叉保護作用

印伯星，車舒雅，張臣臣，顧瑞霞，*

（1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇揚州225009；2.揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇揚州225009；3.江蘇省乳業生物工程技術研究中心，江蘇揚州225004）

乳酸菌能夠提高乳制品的營養價值和功能特性，賦予其特殊的質地和風味，并延長其貨架期[1]。此外，乳酸菌發酵乳制品具有多種益生功能，是目前最受歡迎的功能食品。截至2013年，乳酸菌食品占功能食品市場的比例達到60%～70%（1 060億～1 240億美元）[2]。強健的菌株活性，是乳酸菌發揮益生功能的重要基礎。

在發酵乳生產和貯藏過程中，乳酸菌的代謝活動和菌體組分受到酸、氧化、熱和滲透壓等脅迫的影響，導致活性損失嚴重[3]。現有菌株活性維持手段主要分為脅迫隔離和菌株脅迫抗性增強兩個方面，發酵乳生產和貯藏過程中的部分脅迫難以避免，因而增強菌株的脅迫抗性尤為重要[2]。

研究表明，單一脅迫能夠誘導增強乳酸菌對同類脅迫，及其它脅迫的耐受能力，這種現象稱為交叉適應[4-7]。根據這一規律，利用易于實現的弱脅迫預處理可以提高菌株對復雜脅迫的耐受能力，對于提高菌株的活性具有重要意義。

人源鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）作為重要的益生菌，是研究和應用最廣的新型乳酸菌發酵劑之一。長期的研究和實際應用表明，鼠李糖乳桿菌及其發酵乳具有調整腸道菌群、保護腸道黏膜、緩解腹瀉、調節免疫、預防齲齒和呼吸道感染，以及降低血脂等益生功能[8-9]。人源鼠李糖乳桿菌具有菌毛，是腸道定殖能力最強的乳桿菌，相對于德氏乳桿菌保加利亞亞種、干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌等傳統乳制品發酵菌株更具優勢[10]。大量國內外研究者和生產廠商將鼠李糖乳桿菌應用于乳制品發酵[11-12]。

以L.rhamnosus hsryfm 1301為研究菌株，利用低溫預處理和酸預處理的手段，確定其對生產中常見的氧化、酸、滲透壓和高溫脅迫的交叉適應規律，為提高菌株在脅迫條件下的存活率提供依據。

1 試驗材料、試劑與儀器設備

1.1 菌株

L.rhamnosus hsryfm 1301保藏于江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，菌株放置于MRS培養基中37℃培養。

1.2 試劑

1）MRS培養基配方：葡萄糖20.0 g、蛋白胨10.0 g、醋酸鈉·3H2O 5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、K2HPO4·7H2O 2g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、吐溫 1.0 mL、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、蒸餾水1 L，121℃高溫滅菌20 min。

2）1.0 mol/L HCl配制：用量筒量取43 mL 36%鹽酸倒入燒杯，用適量蒸餾水溶解后，用玻璃棒引流注入500 mL容量瓶，用蒸餾水洗滌燒杯和玻璃棒2次～3次，洗滌液也需引流注入容量瓶中，然后向容量瓶中加蒸餾水至距離刻度線1 cm～2 cm，改用膠頭滴管滴加，直至液面與刻度線相平，蓋上塞子搖勻，裝入試劑瓶，常用保險膜將瓶口封住再旋上瓶蓋并貼上標簽。

3）7.0%NaCl MRS液體培養基：用電子天平稱取3.5 g NaCl固體溶解于50 mL液體培養基中，滅菌后使用。

4）5 mmol/L H2O2的稀釋方法：用移液槍吸取57 μL 30%H2O2于 900 μL 液體 MRS 中，再從中吸取 100 μL混合液于另一支900 μL液體MRS中，重復兩次。

5）pH=4、pH=3的酸性培養基：取兩瓶50 mL液體MRS培養基，用pH計調節溶液為pH=4和pH=3，滅菌后使用。

1.3 儀器設備

BS210S型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；pHS-3C pH計：上海精密科學儀器有限公司；SPIN PLUS小型離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；DK-S12型電熱恒溫水浴器：上海森信實驗儀器有限公司；SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋：南京市江寧電器儀器廠；DGX-9053B-2型生化培養箱：上海福瑪實驗有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司。

2 方法

2.1 菌株的純化與活化

在實驗室儲藏的菌種按曲線劃線接種于MRS固體培養基，置于37℃培養箱培養24 h，挑取單菌落接種分別于3支5 mL MRS液體培養基，置于37℃培養箱培養24 h后，4℃冷藏備用。將純化過的L.rhamnosus hsryfm 1301按照2%的比例轉接至新鮮的5 mL MRS液體培養基中，置于37℃培養箱中培養約15 h。

將純化活化的L.rhamnosus hsryfm 1301按照2%的比例轉接至新鮮的20 mL MRS液體培養基中，37℃靜置培養，待OD值在0.5～0.6之間時進行分裝，等待脅迫處理。

2.2 脅迫預處理

低溫預處理：分裝12支裝有1.0 mL菌液的離心管，將6支放置于15℃培養箱中，處理1 h，其余6支放置于37℃培養箱中培養1 h，1 h后3支15℃與在37℃培養箱中培養1 h的3支1 mL菌液直接點板，記錄菌落形成單位（colony-forming units，CFU）數，剩余的6支進行下一步交叉脅迫。

酸性預處理：將12支1 mL菌液經過經6 000 r/min離心3 min，其中6支換取新鮮的普通液體MRS培養基，另6支換取pH=4的液體培養基，12支均放置于37℃培養箱中，處理1 h，1 h后分別取3支與在37℃培養箱中培養1 h的3支1 mL菌液直接點板，記錄CFU數，剩余的6支進行下一步交叉脅迫。

2.3 脅迫處理

氧化脅迫：在預處理之后，吸取準備好的2 mmol/L H2O2100 μL于6支1 mL菌液中，放置于37℃培養箱中培養1 h后，進行點板，記錄CFU數。

酸性脅迫方法：在預處理后，將6支1 mL菌液經過經6 000 r/min離心3 min，換pH=3的液體MRS培養基1 mL，放置于37℃培養箱中脅迫3 h，3 h后點板，記錄CFU數。

高溫脅迫：在預處理之后，將6支1 mL菌液置于54℃水浴鍋中脅迫1 h，1 h后點板，記錄CFU數。

滲透壓脅迫：在預處理后，將6支1 mL菌液經過經6 000 r/min離心3 min，換7%NaCl的液體MRS培養基1.0 mL，放置于37℃培養箱中脅迫4 h，4 h后點板，記錄CFU數。

2.4 菌落計數

用移液器槍頭吸取100 μL菌液于900 μL普通液體培養基中，稀釋10倍，依次依次稀釋102、103、104和105倍。用移液器吸取5 μL進行點板計數，點板完將平板用保鮮膜包裹好并倒置于37℃培養中培養24 h，選擇菌落數在50～200之間（稀釋梯度為T）的菌斑計數為 N。CFU/mL 計算方法為：CFU/mL=10T×200×N。

3 結果與分析

3.1 低溫預處理

3.1.1 低溫預處理對氧化脅迫的影響

乳酸菌是兼性厭氧菌，氧化脅迫是乳酸菌面臨的最為嚴重的脅迫之一。低溫預處理對L.rhamnosus hsryfm 1301在不同脅迫下的存活率影響見圖1。

圖1 低溫預處理（15℃，1 h）對L.rhamnosus hsryfm 1301在不同脅迫下的存活率影響Fig.1 Survival rate of L.rhamnosus hsryfm 1301 under different stresses with cold pre-treatment（15 ℃，1 h）

結果表明，15℃低溫預處理并未影響L.rhamnosus hsryfm 1301的活菌數量。5.0 mmol/L H2O2氧化脅迫嚴重影響L.rhamnosus hsryfm 1301的活性，處理1 h后，存活率降至萬分之一以下。低溫預處理對不同脅迫前后的活菌數影響見表1。

表1 低溫預處理對不同脅迫前后的活菌數影響Table 1 Live count before and after cross-adaptations with cold pre-treatment

由表1可見，低溫預處理后，L.rhamnosus hsryfm 1301的存活率未受到顯著影響（p＞0.5）。可知低溫預處理并不能對5 mmol/L H2O2氧化脅迫起到保護作用。

3.1.2 低溫預處理對酸性脅迫的影響

鼠李糖乳桿菌是兼性異性乳酸發酵菌，在利用六碳糖時以乳酸為主要產物，發酵終點pH值可達3.0；人體胃液也具有很低的pH值，因而酸脅迫也是鼠李糖乳桿菌要面臨的重要脅迫。表1試驗數據表明，經過低溫預處理的L.rhamnosus hsryfm 1301比沒有經過低溫預處理的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的存活率低（僅低約5%），所以低溫預處理對酸性脅迫沒有交叉保護作用。

3.1.3 低溫預處理對滲透壓脅迫的影響

發酵劑高密度發酵及腌制食品中存在滲透壓脅迫。圖1試驗數據表明，經過低溫預處理的L.rhamnosus hsryfm 1301比沒有經過低溫預處理的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在7.0%NaCl滲透壓脅迫下表現出更高的存活率（約高20%），說明15℃的低溫預處理能夠增強L.rhamnosus hsryfm 1301的滲透壓脅迫耐受能力。

3.1.4 低溫預處理對高溫脅迫的影響

高溫脅迫在發酵乳生產過程中并不常見。但是是發酵劑噴霧干燥中的主要脅迫。表1試驗數據表明，低溫預處理后的菌體與沒有經過低溫預處理的試驗組在54℃高溫脅迫下活菌數變化不大，低溫預處理不能對高溫脅迫產生保護作用。此結果與文獻報道[13]存在差異，體現了乳酸菌脅迫耐受的菌種特異性。

3.2 酸性預處理

3.2.1 酸性預處理對氧化脅迫的影響

酸預處理對L.rhamnosus hsryfm 1301在不同脅迫下的存活率影響見圖2。酸預處理對不同脅迫前后的活菌數影響見表2。

圖2 酸預處理（pH=4，1 h）對L.rhamnosus hsryfm 1301在不同脅迫下的存活率影響Fig.2 Survival rate of L.rhamnosus hsryfm 1301 under different stresses with acid pre-treatment（pH=4，1 h）

由圖2和表2可見，酸預處理后，L.rhamnosus hsryfm 1301的氧化脅迫存活率同樣未受到顯著影響；酸性預處理對L.rhamnosus hsryfm 1301氧化脅迫沒有交叉保護作用。

表2 酸預處理對不同脅迫前后的活菌數影響Table 2 Live count before and after cross-adaptations with acid pre-treatment

3.2.2 酸性預處理對酸脅迫的影響

從表2和圖2可以看出，經過pH=4的酸性預處理比沒有經過pH=4預處理條件的L.rhamnosus hsryfm 1301在pH=3的酸性脅迫下表現出高約11%的活菌存活率，說明pH=4的預處理條件能夠增加鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301抗低酸性的能力。乳酸菌在較弱脅迫的影響下，會采取一定的適應機制，以獲得對同種更強脅迫的耐受能力。L.rhamnosus hsryfm 1301對氧化脅迫也存在同樣的表現[1]。

3.2.3 酸性預處理對滲透壓的影響

圖1試驗數據表明，酸性預處理后的L.rhamnosus hsryfm 1301 在滲透壓脅迫（7%NaCl，4 h）下表現出僅高約3%的活菌數，意味著酸性預處理對滲透壓脅迫沒有保護作用。

3.2.4 酸性預處理對高溫脅迫的影響

表2試驗數據表明，酸性預處理后的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在54℃高溫脅迫下僅表現出高0.07%的活菌數，意味著酸性預處理對54℃高溫壓脅迫沒有保護作用。

4 結論

鼠李糖乳桿菌在生產和消費過程中會遭受氧化、酸、滲透壓和熱等復雜脅迫的影響，活性下降，從而影響生產和益生作用。交叉適應現象的存在為菌株活性維持提供了新的思路。冷脅迫和酸脅迫是生產過程中較容易實現，且對產品影響較小的預處理方式，有望應用于實際生產。酸預處理增強了L.rhamnosus hsryfm 1301對酸脅迫的抵御能力，但是并不能對L.rhamnosus hsryfm 1301的氧化脅迫、滲透壓脅迫和高溫脅迫產生交叉保護作用。低溫預處理不能對氧化脅迫和高溫脅迫起到明顯的交叉保護作用，但是能夠提高菌株對高滲透壓的抵抗能力。本文探究了酸脅迫和低溫脅迫對L.rhamnosus hsryfm 1301的交叉保護作用，低溫預處理有利于提高其在高滲透壓環境中的存活能力。