原料預處理對柿子酒發酵過程中揮發性風味物質的影響

呂佳瑋，劉亞瓊，路瑤，商飛飛，王頡，郭書賢，馬艷莉，，*，牟建樓，*

（1.賀州學院廣西果蔬保鮮和深加工研究人才小高地，廣西賀州542899；2.河北農業大學食品科技學院，河北保定071000；3.南陽理工學院河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室，河南南陽473004）

柿子（Diospyros kaki Thunb.）是一種重要的水果作物，我國是世界上柿子產量最多的國家，也是擁有柿屬植物遺傳資源最豐富的國家，根據國家統計局數據顯示，2016年我國柿子果實產量為396.9萬噸。柿子中含有豐富的酚類，特別是黃酮類和單寧類物質，具有廣泛的生物活性，包括清除自由基[1]、預防心血管疾病和抗癌等[2]。柿子糖含量高，在水果中甜味居于首位，有“最甜的金果子”的美稱，深受人們喜愛，它所含有的游離酸和一些糖類物質，如葡萄糖、果糖和甘露醇等，易于被人體消化和吸收。目前，我國對柿子的利用率較低，柿子加工產品主要以脫澀脆柿子、柿餅為主，還有一些柿醋、柿汁、柿葉茶等。

果酒作為世界暢銷型產品，占據世界飲用酒的15%～20%[3]。近年來，越來越多的研究者開始關注果酒研發，以蘋果、梨子、櫻桃等水果為主要原料釀造的果酒在市場上取得了很大的成功，具有保健功能的植物資源，如山楂、柿子、獼猴桃、芒果、香蕉、橙子、杏等，也越來越多地應用到果酒生產中[4]。以柿子為原料釀造的酒，具有酒精度低、營養價值高、保健功能強的特點[5]。目前柿子酒的釀造工藝需要改善[6]，用不同處理方式處理發酵的柿子酒的研究比較少，特別是原料預處理對柿子酒品質的影響缺乏研究。

本研究以柿子為主要原料，使用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）和氣質聯用（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）技術對不同原料預處理釀造的柿子酒中揮發性風味物質相對含量、種類差異性進行分析，確定各香氣成分對柿子酒香型特征風格的影響，以期為柿子酒的生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磨盤柿：2018年采摘于河北省保定市，采后放置于4℃冷庫儲藏備用；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶 LYSIS MPC（2.25×104U/g）：煙臺帝伯仕自釀機公司；氯化鈉（分析純）：天津天利化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

5977A氣相色譜與質譜聯用設備：美國Agilent有限公司；HH-4電熱水浴鍋：上海比朗儀器有限公司；ID5002C電子天平：天津天馬橫基儀器有限公司；SPX型生化培養箱：上海東器實業有限公司；DHG-9146A電熱恒溫鼓風干燥箱：廣東精華智能裝備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 柿子酒釀造工藝流程

柿子→挑選→去柄→打漿→不同處理→加入酵母→發酵檢測→澄清→過濾→成品

1.3.2 酵母活化

將活性干酵母和2%的葡萄糖水按照1∶10（g/mL）的比例混合于小燒杯中，小心靜置在36℃～38℃的恒溫水浴鍋中，每隔10 min輕輕搖晃一次，有豐富濃密的小氣泡產生，即代表活化成功，時間在20 min～30 min為宜[7]。

1.3.3 果膠酶對柿子酒發酵過程中揮發性風味物質的影響

為了研究果膠酶對柿子酒發酵過程中揮發性風味物質的影響，稱取4 000 g成熟度高的柿子，進行挑選、去柄、打漿，將柿子漿分為2組，一組中加入0.1%的果膠酶，在45℃水浴中水浴3 h，另一組不加果膠酶。將釀酒酵母進行活化，酵母活化同1.3.2，將活化好的酵母加入到處理好的柿子漿中，將兩組柿子漿分別分裝到15個發酵瓶中，每3個作為平行試驗，在24℃恒溫培養箱中發酵8 d，每隔1 d進行取樣，將取出的樣品貯藏在-4℃冰箱中備用，測量柿子酒發酵過程中揮發性風味成分。

1.3.4 去皮對柿子酒發酵過程中揮發性風味物質的影響

為了研究去皮對柿子酒發酵過程中揮發性風味物質的影響，稱取4 000 g成熟度高的柿子，進行挑選、去柄，將挑選好的柿子分為2組，一組做去皮處理，另一組不做去皮處理。將兩個處理進行打漿，加入0.1%的果膠酶，在45℃水浴中處理3 h[8]。將釀酒酵母進行活化，酵母活化方法同1.3.2，將活化好的酵母，加入到處理好的柿子漿中，攪拌均勻，將兩個處理柿子漿分別分裝到15個發酵瓶中，每3個作為平行試驗，在24℃恒溫培養箱中發酵8 d[9]，每隔1 d進行取樣，將樣品貯藏在-4℃冰箱中備用，測量柿子酒發酵過程中揮發性風味成分。

1.3.5 蒸煮對柿子酒發酵過程中揮發性風味物質的影響

為了研究蒸煮對柿子酒發酵過程中揮發性風味物質的影響，稱取4 000 g成熟度的柿子，進行挑選、去柄、打漿，將柿子漿分為2組，一組將柿子漿煮15 min，另一組不做蒸煮處理。待柿子漿冷卻，兩個處理均加入0.1%的果膠酶，在45℃水浴中處理3 h。將釀酒酵母進行活化，酵母活化方法同1.3.2，將活化好的酵母，加入到處理好的柿子漿中，攪拌均勻，將兩個處理柿子漿分別分裝到15個發酵瓶中，每3個作為平行試驗，在24℃恒溫培養箱中發酵8 d，每隔1 d進行取樣，將樣品貯藏在-4℃冰箱中備用，測量柿子酒發酵過程中揮發性風味成分。

1.3.6 揮發性風味物質測定方法

1.3.6.1 柿子酒揮發性風味物質的萃取

參照齊曉茹等[10]的方法并稍作改進，取樣品7.5 mL于鉗口瓶，加入1.0 gNaCl。在40℃恒溫水浴鍋中平衡15 min，之后插入纖維頭吸附40 min，取出后立即在氣相色譜（gas chromatography，GC）進樣口解析 6 min，開始運行方法。

1.3.6.2 氣相色譜條件

進樣口溫度240℃，載氣氦氣，流速1.45 mL/min，不分流。柱箱升溫程序：先以50℃的升溫程序，保持2 min，再以3℃/min的升溫速度升至80℃，隨之以5℃/min的升溫速度升至230℃，保持6 min。質譜條件：電離方式EI，離子源溫度240℃，電子電壓70 eV，檢測器電壓350 V，輔助加熱器溫度250℃，四級桿溫度150℃，采用全掃描（Scan）模式采集信號，掃描范圍33 m/z～550 m/z。

1.3.7 數據處理方法

試驗結果統計分析方法使用SPSS17.0軟件進行統計分析，差異顯著性水平為0.05，使用Origin9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 不同原料預處理柿子酒中主要揮發性風味物質

使用HS-SPME和GC-MS技術檢測不同原料預處理柿子酒中揮發性香氣物質[11]，其揮發性風味物質總離子流圖如圖1所示。

原料去皮處理、帶皮處理、蒸煮處理、不蒸煮處理、添加果膠酶、不加果膠酶分別檢測出揮發性風味物質43、47、42、46、44、38 種，主要揮發性香氣物質如表 1所示。

柿子酒中的主要揮發性風味物質主要有酯類、醇類、酸類、醛酮類和其他類。主要酯類物質包括正己酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、癸酸甲酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、月桂酸乙酯、丁酸乙酯、庚酸乙酯，原料去皮和蒸煮處理中未檢測到庚酸乙酯，不加果膠酶未檢測到丁酸乙酯、庚酸乙酯。主要的醇類物質包括異戊醇、異丁醇、3-甲硫基丙醇、（R）-（+）-β-香茅醇、2，3-丁二醇、4-萜烯醇、苯乙醇、甘油，原料去皮處理和蒸煮處理未檢測到4-萜烯醇，而不添加果膠酶處理中僅檢測到（R）-（+）-β-香茅醇、2，3-丁二醇、苯乙醇三種醇類物質。主要的酸類物質包括辛酸、癸酸、月桂酸、己酸、棕櫚油酸、乙酸，棕櫚油酸在去皮處理和不加果膠酶處理中未檢測到，主要醛酮類物質包括苯甲醛、苯乙醛、5-羥甲基糠醛、5-甲基呋喃醛、2-甲基四氫噻吩-3-酮、3-羥基-2-丁酮，其他類物質包括苯乙烯、環十二烷、環辛四烯、正十三烷、右旋萜二烯。不同處理發酵的柿子酒揮發性風味物質有所差異，說明不同原料預處理對柿子酒中揮發性風味物質有影響。

圖1 柿子酒揮發性風味物質GC-MS總離子流圖Fig.1 Persimmon wine GC-MS total ions chromatogram of volatile flavor substances

表1 不同原料預處理對柿子酒中主要揮發性風味物質的影響Table 1 Effects of different material pretreatments on main volatile flavor substances in persimmon liquor

續表1 不同原料預處理對柿子酒中主要揮發性風味物質的影響Continue table 1 Effects of different material pretreatments on main volatile flavor substances in persimmon liquor

2.2 添加果膠酶對柿子酒發酵過程中揮發性風味物質的影響

添加果膠酶對柿子酒發酵過程中揮發性風味物質的影響如圖2所示。

加果膠酶處理的柿子酒中酯類物質含量遠遠高于不加果膠酶處理的，說明加果膠酶可以增加柿子酒的酯類物質。加果膠酶處理和不加果膠酶處理的柿子酒中共檢測出酯類物質14和11種，含量分別為其44.48%、25.82%，其中，月桂酸甲酯（酒香、花香）、十一酸乙酯（葡萄酒香、酯香、果香、椰香）、丁酸乙酯（蘋果香）、丁二酸二乙酯（有愉快氣味）、己酸異戊酯（巧克力）僅在加果膠酶處理組檢出，很好修飾了柿子酒中的香氣成分[13]。

圖2 添加果膠酶對柿子酒發酵過程中揮發性風味物質的影響Fig.2 Effect of pectinase addition on volatile flavor compounds in fermentation process of persimmon wine

醇類是酒精發酵主要產物之一，主要由糖代謝、氨基酸脫羧和脫氫產生，它能賦予酒特有的香氣[14]結果表明，加果膠酶處理的柿子酒中醇類物質含量比不加果膠酶處理的含量高，前者共檢出7種醇類物質，含量為31.56%，后者檢出5種醇類物質，含量為25.84%，相對含量較高的醇類有異戊醇（有蘋果白蘭地香氣）、正己醇（葉子風味、青草味、吐司味）、苯乙醇（玫瑰花香、薔薇花香、香粉味），果膠酶的添加能有效地減少異丁醇、糠醇、庚醇的生成，并能促進果汁中香氣物質的釋放。

柿子酒中的酸類物質大部分是酒精發酵和蘋乳發酵的副產物，有研究發現，酸類物質含量在合適范圍內時，對酒的感官品質有積極貢獻，為酒帶來新鮮感并平衡果香[15]。如圖2c所示，不加果膠酶處理發酵的柿子酒中酸類物質含量遠遠高于加果膠酶處理，主要的酸類物質有辛酸（奶酪味、腐敗味、澀味）、癸酸（不愉快的脂肪味）、己酸（類似甜味）、乙酸（酸味和辛辣刺激味），果膠酶的添加能明顯減少酒中辛酸和癸酸的釋放，對酒體風味起一定保護作用。

其他類物質包括醛、酮、以及呋喃等物質，這些物質大多對酒體的香氣品質有消極影響[16]，加果膠酶處理的柿子酒中共檢出9種，相對含量為5.73%，不加果膠酶處理的柿子酒中共檢出10種，相對含量為10.57%，果膠酶的添加能減少這類物質的產生，對酒的香氣有一定保護作用。

綜上所述，果膠酶的加入增加了酒中酯類和醇類物質的含量和種類，豐富了柿子酒的香氣，減少了辛酸、癸酸的釋放和一些對酒品質有消極影響的醛、酮、以及呋喃等物質，所以，添加果膠酶為較合適的原料預處理方法。

2.3 去皮對柿子酒發酵過程中揮發性風味物質的影響

去皮對柿子酒發酵過程中揮發性風味物質的影響如圖3所示。

圖3 去皮對柿子酒發酵過程中揮發性風味物質的影響Fig.3 Effect of peeling on volatile flavor substances during fermentation of persimmon wine

在發酵過程中，帶皮處理發酵的柿子酒中的酯類物質含量比去皮處理發酵的柿子酒中酯類物質含量高（圖3a），十三烷酸乙酯、異戊酸己酯、甲酸苯酯、10-甲基十一烷酸甲酯、十五酸乙酯等僅在帶皮處理組檢測出，去皮處理組未檢出，在帶皮處理發酵和去皮處理的柿子酒中分別檢測出17種和15種酯類物質，分別占總香氣成分的43.74%、34.35%，其中含量較多的的酯類物質有辛酸乙酯（果香、菠蘿、梨、花香）、乙酸苯乙酯（玫瑰花香、蜂蜜香）、癸酸乙酯（白蘭地酒香味）、月桂酸乙酯（花香、果香、肥皂味）等，去皮處理降低了正己酸乙酯、乙酸異戊酯等大部分酯類物質的含量，減少了柿子酒中青蘋果、茴香味、類似香蕉香味等特殊香氣，而去皮處理中棕櫚酸乙酯的含量較高，增添了蠟香、果醬、奶油香味。

由圖3b所示，在發酵前2 d帶皮處理發酵的柿子酒中醇類物質比去皮處理組的高，在發酵后4 d，去皮處理發酵的柿子酒中醇類物質含量較高，香茅醇、芐醇、4-萜品醇僅在去皮處理組檢出，而帶皮組未檢出，3-甲基-1-戊醇僅在帶皮處理組檢出，在帶皮處理發酵和去皮處理的柿子酒中分別檢測出9種和6種醇類物質，分別占總香氣成分的42.91%、40.86%，其中含量較多的醇類物質有異戊醇（有蘋果白蘭地香氣）、苯乙醇（玫瑰花香、薔薇花香、香粉味）、3-甲硫基丙醇（低濃度有強烈芬芳的肉或肉湯香氣）等，去皮處理降低了醇類物質的含量，減少了香氣的濃度，但是，去皮處理增加了柿子酒中3-甲硫基丙醇的含量。

在發酵過程中，兩種處理發酵的柿子酒中酸類物質含量呈現先上升后下降的趨勢，酒中的揮發酸主要來源于酒精發酵，其含量取決于發酵條件、發酵汁的營養水平和酵母[17]。在帶皮處理發酵和去皮處理的柿子酒中分別檢測出4種和7種酸類物質，分別占總香氣成分的11.02%、22.85%，其中乙酸（酸味和辛辣刺激味）、辛酸（奶酪味、腐敗味、澀味）、癸酸（不愉快的脂肪味）、己酸（類似甜味）、苯甲酸、乙酸（酸味和辛辣刺激味）等含量較高，而去皮處理增加的酸類物質的含量。

去皮處理對柿子酒發酵過程中醛酮類以及其他類物質的影響如圖3d和3e所示。兩個處理中醛酮類物質和其他物質的含量隨發酵進行而下降，癸醛、5-甲基呋喃醛、2，4-二叔丁基苯酚（石炭酸味）、苯酚、右旋萜二烯（似鮮花的清淡香味）等物質僅在去皮處理中檢出。

綜上所述，帶皮處理發酵的柿子酒中醇類物質和酯類物質均含量高于去皮處理的，而酸類物質和醛酮類物質均低于去皮處理，帶皮處理的柿子酒中具有濃郁的果香，苦澀味等不愉快風味明顯減少，所以帶皮處理為較合適的柿子酒釀造的原料預處理方法。

2.4 蒸煮對柿子酒發酵過程中揮發性風味物質的影響

蒸煮對柿子酒發酵過程中揮發性風味物質的影響如圖4所示。

圖4 蒸煮對柿子酒發酵過程中揮發性風味物質的影響Fig.4 Effect of cooking on volatile flavor compounds in fermentation process of persimmon wine

酯類物質含量隨著發酵時間的增長呈現先上升后下降的趨勢（圖4a所示），發酵前期酯類物質含量升高是酵母菌生長代謝產生，主要是發生脂肪氧化、氨基酸代謝、酸和醇的縮合反應[18]，而后期其含量下降可能是由于作為了某些反應的反應物，生成了其他物質。蒸煮組無論是在發酵過程中還是發酵最后都比不蒸煮組的含量高，這可能是因為蒸煮過程中，醇和酸發生了有效的碰撞，從而使酯類物質含量上升，癸酸甲酯、庚酸乙酯、十四酸乙酯、月桂酸甲酯、辛酸3-甲基丁酯、苯甲酸乙酯、乙酸蘇合香酯、3-羥基丁酸乙酯等是不蒸煮組特有的酯類，而蒸煮組中沒有檢測到，這些酯類具有豐富水果香氣和花香，9-癸烯酸乙酯具有脂肪、輕微果香，僅在蒸煮組檢出。1-戊醇、（R）-（+）-β-香茅醇分別在不蒸煮組第0天和第8天檢測出。蒸煮處理發酵成品酒中檢測出12種，不蒸煮處理發酵成品酒中檢測出13種，主要的酯類物質有正己酸乙酯（青蘋果、茴香味）、辛酸乙酯（果香、菠蘿、梨、花香）、乙酸苯乙酯（玫瑰花香、蜂蜜香）、丁二酸二乙酯（有愉快氣味），蒸煮處理增加了正己酸乙酯、辛酸乙酯的含量，而降低了乙酸苯乙酯、丁二酸二乙酯的含量。

如圖4b所示，兩組處理醇類物質含量隨發酵的進行呈先上升后下降，不蒸煮處理柿子酒的醇類物質含量比蒸煮處理醇類物質含量高，十二醇僅在蒸煮組第0天檢出。發酵終點蒸煮組柿子酒中揮發性香氣檢出物中醇類物質的種類分為6種，相對含量為37.93%。不蒸煮組柿子酒中揮發性香氣檢出物中醇類的種類分別8種，相對含量為46.78%。在醇類物質中，兩種處理中的苯乙醇（玫瑰花香、薔薇花香、香粉味）和異戊醇（溫和的特殊氣味）含量較高，而蒸煮處理降低了醇類物質的含量。

如圖4c所示，在發酵的前4 d，不蒸煮處理組柿子酒中酸類物質含量比蒸煮處理組柿子酒中酸類物質含量高，這可能是因為蒸煮過程加快了酸類物質與醇類物質反應，從而使酸類物質含量較低，而到發酵后4 d時，蒸煮處理組柿子酒中酸類物質含量比不蒸煮處理組柿子酒中酸類物質含量高，在酸類物質中，乙酸、辛酸（奶酪味、腐敗味、澀味）、癸酸（不愉快的脂肪味）、月桂酸（微有月桂油香氣）含量較高。蒸煮處理發酵的柿子酒中共檢測出5種酸類物質，而不蒸煮處理發酵的柿子酒中共檢測出7種酸類物質。

蒸煮處理對柿子酒發酵過程中醛酮類以及其他類物質的影響如圖4d和4e所示。3-羥基-2-丁酮、壬醛、右旋萜二烯、苯并環丁烯僅在蒸煮處理發酵的柿子酒中檢測出，其中右旋萜二烯有似鮮花的清淡香味，是在釀造過程中由于糖苷酶酶解生成的香氣化合物[19]。

綜上所述，蒸煮處理增加了正己酸乙酯（青蘋果、茴香味）、辛酸乙酯（果香、菠蘿、梨、花香）的含量，果香味增加，減少了乙酸、辛酸（奶酪味、腐敗味、澀味）、癸酸（不愉快的脂肪味）等的含量，不愉快風味較少，所以蒸煮處理為較合適的原料預處理方法。

3 結論

使用HS-SPME和GC-MS聯用技術對不同原料預處理釀造的柿子酒揮發性風味物質進行分析，原料去皮處理、帶皮處理、蒸煮處理、不蒸煮處理、添加果膠酶、不加果膠酶分別檢測出揮發性風味物質43、47、42、46、44、38 種，主要揮發性風味物質以酯類、醇類、酸類為主，還有少量醛酮類、萜烯類；去皮處理減少了酯類物質的含量，癸酸、辛酸等脂肪酸的含量升高，對柿子酒香氣成分有負面影響；蒸煮處理提高了酯類和萜烯類物質的含量；果膠酶的添加能減少揮發酸的生成，同時能起到很好的澄清作用，帶皮、蒸煮、加果膠酶處理能很好的改善柿子酒的香氣組成，所以確定帶皮、蒸煮、添加果膠酶為柿子酒較優的原料處理方法。