光照、氮素和高鹽脅迫對雨生紅球藻積累蝦青素的影響研究

陳家宇，李嘉儀，竇勇，*，吳琳，任虹燁，閆永芳，周文禮，于士國

（1.天津農學院天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津300384；2.天津蘊華農業科技發展有限公司，天津 301823）

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種單細胞微藻，在分類學上隸屬于綠藻門、綠藻綱、團藻目、紅球藻科、紅球藻屬。細胞寬約 19 μm～51 μm，長約28 μm～63 μm，生殖方式為單細胞孢子生殖或合子生殖。雨生紅球藻的生活史呈現多樣性，但主要分為游動階段細胞和不動階段細胞兩種狀態。游動階段細胞呈卵圓形或橢圓形，細胞運動依靠兩條頂生、等長的鞭毛，這一階段的細胞大多呈綠色，偶爾也呈紅色；不動階段細胞呈圓形，沒有鞭毛不能運動，主要呈現紅色，在此階段微藻細胞開始逐漸合成并積累蝦青素。雨生紅球藻細胞內蝦青素含量占到干重的1.5%～10%，因此被公認為自然界中生產天然蝦青素的最佳生物[1]。2010年11月11日國家衛生部批準將雨生紅球藻納入新資源食品目錄，成為少數幾種獲得國家認可的食品級微藻。在水產養殖領域雨生紅球藻同樣有著廣泛應用，由于粒徑適中、營養豐富常用作魚蝦育苗的開口餌料。另外雨生紅球藻在生長過程中會產生堿性物質，可以有效中和養殖水體的酸度，起到調節水質維持環境健康的作用，因此是水產養殖過程中最常用的植物性生物餌料之一[2]。

蝦青素（Astaxanthin）是一種脂溶性類胡蘿卜素，屬于萜烯類不飽和化合物，分子式為C40H52O4。蝦青素最早是從水產動物組織、螯蝦外殼及海藻細胞中發現，是目前為止在自然界有機體中發現的抗氧化能力最強的物質，它清除自由基和單線態氧淬滅的能力遠遠高于維生素E，比玉米黃質、番茄紅素及β-胡蘿卜素等常見抗氧化物質的抗氧化能力也要高10倍以上，因此蝦青素具有抑制腫瘤、提高肌體免疫力、清除活性氧和自由基等作用[3-4]。此外蝦青素還有良好的著色效果，可以進入生物體并貯存在組織中，使某些動物的肌肉和皮膚呈現鮮亮的顏色（如紅鱔魚、大馬哈魚等）[5]，我國農業部318號文中指定天然蝦青素為水產動物唯一著色劑。另外蝦青素在在食品、保健品、藥品、化妝品等領域都有很好的應用前景。

本研究利用試驗生態學方法，探索了光照強度、NaNO3和NaCl濃度對雨生紅球藻光合作用和積累蝦青素的影響，為雨生紅球藻作為“生物反應器”高產蝦青素提供一定的數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

KOH、甲醇、丙酮（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.1.2 設備

光照培養箱（KCLP-1000CCFL-CT）：東樂生命科學公司；浮游植物分類熒光儀（PHYTO-PAM WALZ）：德國WALZ有限公司；生物顯微鏡（E200）：日本Nikon有限公司；冷凍箱（HYCD-205）：青島海爾有限公司；高壓滅菌鍋（HVE-50）：北京興盛恒創有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-1FD）：上海博訊有限公司；分析天平（TOLEDO PL203）：梅特勒-托利公司。

1.2 試驗藻種

雨生紅球藻來自天津市水產生態及養殖重點實驗室。試驗培養雨生紅球藻采用pH 7的BBM培養基[6]。

1.3 試驗設計

1.3.1 對照組培養條件

將培養至對數生長期（5×105個/mL）的雨生紅球藻接種到BBM培養基，光照強度設置為55 μmol/m2/s，光暗比為 12 h∶12 h，培養溫度為（22±1）℃，每個試驗組設置3個平行，每天搖動培養瓶6次，防止細胞附壁或下沉。

1.3.2 光照脅迫培養條件

將培養至對數生長期（5×105個/mL）的雨生紅球藻接種到BBM培養基，光照強度設置5個梯度，分別為73、127、182、236、291 μmol/m2/s，其它培養條件同 1.3.1。

1.3.3 NaNO3脅迫培養條件

將培養至對數生長期（5×105個/mL）的雨生紅球藻接種到不含有NaNO3的BBM培養基，NaNO3濃度設置 5 個梯度，分別為 0、0.032、0.065、0.13、0.25 g/L，光照強度設置為55 μmol/m2/s，其它培養條件同1.3.1。

1.3.4 NaCl脅迫培養條件

將培養至對數生長期（5×105個/mL）的雨生紅球藻接種到不含有NaCl的BBM培養基，NaCl濃度設置5 個梯度，分別為 0、5、7.5、10、12.5 g/L，光照強度設置為 55 μmol/m2/s，其它培養條件同 1.3.1。

1.4 測定指標

試驗周期為26 d，每2 d取樣測定雨生紅球藻細胞的葉綠素熒光參數和蝦青素含量。

1.4.1 葉綠素熒光參數測定

利用熒光分析儀（PHYTO-PAM WALZ）測定葉綠素熒光參數，在測定開始前將取得的樣品避光暗處理15 min，然后通過讀取參數得出最大光能轉化效率（Fv/Fm）、實際光能轉化效率（PSⅡ）、有效光能轉化效率值（Yield）。

1.4.2 蝦青素含量測定

參照李嘉儀等[7]以及韋韜等[8-9]的方法測定蝦青素含量。取5 mL藻液進行離心，棄去上清液，加入5 mL超純水清洗，重復兩次。然后用5 mL的5%氫氧化鉀+30%甲醇水混合溶液破壞葉綠素5 min，棄去上清液后加5 mL超純水清洗兩次。棄去上清液后將收集到的藻泥中加入2 mL丙酮，用細胞破碎儀處理10 min，4℃離心15 min（10 000 r/min），保留上清液，重復以上操作，直至藻團呈白色，色素提取完全為止。

蝦青素的含量參照Davies等的采用公式[10]：

蝦青素（mg/L）=4.6×A480ast×稀釋倍數

1.5 數據處理

使用SPSS 17.0統計軟件對試驗數據進行單因素方差分析，采用Duncan’s多重比較檢驗處理組均值的差異顯著性，顯著性水平設定為0.05。利用EXCEL 2016進行繪圖。

田力（1965.06.15-），女，漢族，河南人，博士，河南中醫藥大學副校長，研究方向：超聲醫學，e-mail：tianli@hactcm.edu.cn。

2 結果與分析

2.1 光照脅迫對雨生紅球藻葉綠素熒光參數的影響

光照脅迫對雨生紅球藻葉綠素熒光參數的影響見圖1。

圖1 光照強度對雨生紅球藻熒光參數的影響Fig.1 Effect of light intensity on fluorescence parameters of Haematococcus pluvialis

隨脅迫時間延長，光照脅迫處理組微藻Fv/Fm和Yield參數均低于對照組，而對照組的Fv/Fm值一直維持在0.5～0.6之間。隨著試驗的進行，雨生紅球藻Fv/Fm值在第4天后出現明顯下降，在第10天后趨于穩定，在第26天各試驗組微藻Fv/Fm較初始水平下降了8%～37.9%。在第16、18、24和26天光照脅迫處理組的Fv/Fm顯著低于對照組（P＜0.05），光照脅迫處理組Fv/Fm在第10天后顯著上升然后逐漸趨于穩定，且不同強度的光照脅迫組之間并差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 光照脅迫對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

光照脅迫對雨生紅球藻積累蝦青素的影響見圖2。

圖2 光照強度對雨生紅球藻積累蝦青素的影響Fig.2 Effect of light intensity on accumulation of astaxanthin in Haematococcus pluvialis

由圖2可知，在光照脅迫處理下雨生紅球藻胞內蝦青素含量逐漸升高，各光照脅迫處理組與對照組相比均存在顯著差異（P＜0.05）。當光照強度較低時（55 μmol/m2/s～73 μmol/m2/s） 微藻細胞內蝦青素含量較低僅為2.5 mg/L～4 mg/L，而高強度光照能夠促進雨生紅球藻積累蝦青素的過程，光照強度127、182、236 μmol/m2/s條件下雨生紅球藻胞內蝦青素水平明顯上升。在試驗的第24天光照強度為236 μmol/m2/s的處理組微藻積累蝦青素水平達到最高值9.01 mg/L，較對照組提高了55.5%。

2.3 NaNO3脅迫對雨生紅球藻葉綠素熒光參數的影響

NaNO3脅迫對雨生紅球藻葉綠素熒光參數的影響見圖3。

由圖3可知，微藻細胞Fv/Fm整體呈先上升后逐漸下降的趨勢，各NaNO3脅迫處理組較對照組有顯著差異（P＜0.05），無NaNO3處理組Fv/Fm在第10天達到最高值。NaNO3濃度為0.13和0.25 g/L時，雨生紅球藻細胞的Fv/Fm和Yield與對照組相比差異并不顯著（P＞0.05）。

圖3 NaNO3濃度對雨生紅球藻熒光參數的影響Fig.3 Effect of NaNO3concentration on fluorescence parameters of Haematococcus pluvialis

2.4 NaNO3脅迫對雨生紅球藻積累蝦青素含量的影響

NaNO3脅迫對雨生紅球藻積累蝦青素的影響如圖4所示。

由圖4可知，NaNO3濃度為0時微藻細胞內積累蝦青素的水平顯著高于其他試驗組（P＜0.05）。氮缺乏是雨生紅球藻積累蝦青素的主要影響因子之一，但雨生紅球藻細胞在綠色游動階段會積累一定水平的氮源，當細胞處于缺氮環境時會首先消耗自身儲存的氮源，等氮素全部消耗完畢后才開始積累蝦青素。無NaNO3處理組雨生紅球藻在前14 d積累蝦青素速率較低，第14天到第22天蝦青素合成速率明顯加快，并于第22天達到峰值5.60 mg/L，此時微藻胞內蝦青素含量較第14天時增高了34%。

2.5 NaCl脅迫對雨生紅球藻葉綠素熒光參數的影響

圖4 NaNO3濃度對雨生紅球藻積累蝦青素的影響Fig.4 Effect of NaNO3concentration on accumulation of astaxanthin in Haematococcus pluvialis

由圖5可知，試驗期間NaCl脅迫處理的雨生紅球藻細胞Fv/Fm和Yield基本維持穩定，NaCl濃度為10和12.5 g/L時雨生紅球藻的Fv/Fm和Yield值均低于對照組，而NaCl濃度為5 g/L時微藻細胞Fv/Fm和Yield值均高于對照組。

2.6 NaCl脅迫對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

NaCl脅迫對雨生紅球藻積累蝦青素的影響如圖6所示。

由圖6可知，在NaCl脅迫處理下雨生紅球藻細胞內蝦青素含量呈先逐漸升高后趨于穩定的變化趨勢，其中5、7.5、10 g/L濃度組胞內蝦青素含量與對照組相比差異顯著（P＜0.05），12.5 g/L濃度組與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。從試驗第12天后7.5 g/L濃度組微藻細胞積累蝦青素水平顯著高其它試驗組（P＜0.05），在第24天微藻細胞內積累蝦青素含量達到峰值，較其它試驗組提高了13%～45%。當5、7.5、10 g/L濃度組時雨生紅球藻積累蝦青素的水平顯著高于12.5g/L濃度組（P＜0.05）。

圖5 NaCl濃度對雨生紅球藻熒光參數的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration on fluorescence parameters of Haematococcus pluvialis

圖6 NaCl濃度對雨生紅球藻積累蝦青素的影響Fig.6 Effect of NaCl concentration on accumulation of astaxanthin in Haematococcus pluvialis

3 討論

3.1 光照脅迫對雨生紅球藻熒光參數和積累蝦青素的影響

微藻細胞葉綠素熒光參數主要受PSⅡ光合反應中心結合的醌受體QA的氧化還原狀態以及光合電子傳遞過程中產生的熱耗散控制[11]。Hernando等研究表明高強度的光照會抑制微藻細胞PSⅡ光合反應中心的活性，當超出PSII自我修復的能力時，藻細胞會受到明顯的傷害[12]。

雨生紅球藻的生長、繁殖與蝦青素的積累與光照強度關系密切。在適宜的光強范圍內，光照強度提高可促進雨生紅球藻的光合作用，加強藻細胞生理代謝和物質合成，但當光照強度超過雨生紅球藻的承受能力，微藻光合作用將受到抑制[13]。本試驗發現，在第24天，光照強度為236 μmol/m2/s的處理組藻細胞內蝦青素水平最高達9.01 mg/L，且顯著高于其它試驗組（P＜0.05），但是當光照強度達到291 μmol/m2/s時微藻細胞內蝦青素的積累量下降，僅為7.91 mg/L。有發現在光照強度為 50 μmol/m2/s～240 μmol/m2/s時，雨生紅球藻細胞中的蝦青素含量隨著光照強度增強而上升，與本研究的結論一致。才金玲等[14]認為高光強使雨生紅球藻光合作用和含氮化合物的生物合成減弱，微藻細胞出現脅迫應激，細胞內與蝦青素合成相關的基因被激活，微藻開始合成并積累蝦青素，而蝦青素具有保護細胞免受脅迫傷害的作用[15]。

3.2 NaNO3脅迫對雨生紅球藻熒光參數和積累蝦青素的影響

氮是微藻不可或缺元素，氮缺乏會影響微藻的生長繁殖，干擾葉綠素、蛋白質及核酸等大分子的生物合成，并削弱光合反應速率和水平[16-17]。Marin等[18]發現氮脅迫使杜氏鹽藻的Fv/Fm水平下降，與本研究的結果一致。在氮脅迫初期雨生紅球藻葉綠素熒光參數均有不同程度變化，說明微藻受到缺氮脅迫時光化學活性會瞬時升高，脅迫時間延長藻細胞因為氮素缺乏其光合作用受到抑制，葉綠素熒光參數逐漸恢復穩定。

低氮脅迫可誘導雨生紅球藻細胞啟動合成蝦青素的保護機制。Borowitzka等[19]、鄒寧等[20]研究均發現當氮素在低濃度下均可快速脅迫雨生紅球藻積累蝦青素。本試驗發現隨著培養環境中氮素含量的減少，雨生紅球藻積累蝦青素的水平明顯提高，缺氮可促進微藻內蝦青素的合成，當培養基氮源濃度為0時，經過22 d培養雨生紅球藻細胞中的蝦青素含量達到峰值。莊惠如等[21]、楊瑾等[22]研究發現當雨生紅球藻培養基中氮元素的濃度減少一半時有利于蝦青素積累，且微藻細胞內的蝦青素水平與氮濃度呈反比，這與本研究的結論一致。

3.3 NaCl脅迫對雨生紅球藻熒光參數和積累蝦青素的影響

細胞葉綠素熒光參數的變化可在一定程度反映環境因子對微藻的影響。有研究表明在適宜的環境條件下Fv/Fm趨于穩定，當微藻細胞受到高鹽脅迫處理后該值明顯下降[23]，本研究中高鹽脅迫下NaCl濃度為10、12.5 g/L，雨生紅球藻細胞的Fv/Fm均低于對照組的結果正印證了這一點。高鹽脅迫抑制藻類光合作用的影響機制主要表現在PSⅡ受到氧化損傷[24]以及轉換態轉換而引起的損傷[25]。

高鹽脅迫是誘導雨生紅球藻合成蝦青素常用方法，探究適宜鹽濃度范圍對雨生紅球藻高效合成蝦青素有重要的實踐意義[26]。雖然高鹽脅迫對雨生紅球藻細胞的生長存在抑制，但能促進雨生紅球藻綠色細胞快速轉變為紅色孢子狀并累積蝦青素。本研究發現高鹽脅迫處理促進雨生紅球藻細胞積累蝦青素，在試驗第22天試驗組微藻細胞積累蝦青素水平達到峰值并趨于穩定，第24天高鹽脅迫使雨生紅球藻細胞全部由綠色游動階段轉變為紅色不動孢子，與Huang的研究結果一致。Huang等[27]的研究發現濃度低于10 g/L的NaCl能誘導雨生紅球藻快速積累蝦青素。Boussiba等[28]的研究表明當培養環境中的NaCl濃度增加3倍時，雨生紅球藻合成蝦青素的速率明顯上升。然而高鹽脅迫促進雨生紅球藻合成蝦青素的具體調控機制制目前尚不清楚，有待進一步探究。

4 結論

1）光照脅迫處理組微藻Fv/Fm和Yield參數均低于對照組。在光照脅迫處理下雨生紅球藻胞內蝦青素含量逐漸升高，各光照脅迫處理組與對照組相比均存在顯著差異（P＜0.05）。高強度光照能夠促進雨生紅球藻積累蝦青素的過程，在試驗的第24天光強為236 μmol/m2/s的處理組微藻積累蝦青素水平達到最高值9.01 mg/L，較對照組提高了55.5%。

2）NaNO3脅迫處理使雨生紅球藻細胞Fv/Fm整體呈先上升后逐漸下降的趨勢，各NaNO3脅迫處理組較對照組有顯著差異（P＜0.05）。NaNO3濃度為0 g/L時微藻細胞內積累蝦青素的水平顯著高于其他試驗組（P＜0.05）。無NaNO3處理組雨生紅球藻在前14 d積累蝦青素速率較低，第14天到第22天蝦青素合成速率明顯加快，并于第22天達到峰值5.60 mg/L。

3）NaCl脅迫處理下的雨生紅球藻細胞Fv/Fm和Yield基本維持穩定。在NaCl脅迫處理下雨生紅球藻細胞內蝦青素含量呈先逐漸升高后趨于穩定的變化趨勢，其中5、7.5、10 g/L濃度組胞內蝦青素含量與對照組相比差異顯著（P＜0.05），12.5 g/L濃度組與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。從試驗第12天后7.5 g/L濃度組微藻細胞積累蝦青素水平顯著高其它試驗組（P＜0.05），在第24天微藻細胞內積累蝦青素含量達到峰值。