采用雙歧桿菌發酵迷迭香扣碗酪的工藝及抗氧化研究

馮紅霞，朱立紅，韓躍軍，馬立志，費鵬，李建軍，常云鶴，*

（1.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州貴陽550005；2.河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽471023）

扣碗酪是我國傳統的宮廷發酵乳制品，主要利用米酒進行發酵，不需要排乳清，因此，產品不但兼有乳香和酒香，二者融合，風味獨特，而且更好的保留了乳中的營養物質[1]。扣碗酪含有豐富的蛋白質、維生素和多種礦物質，且在發酵過程中大分子的營養物質被分解為小分子，更利于人體消化吸收，深受消費者的喜愛[2-3]。然而，現有關于扣碗酪的研究多集中在其發酵工藝中，這使得扣碗酪產品相對單一，不能滿足消費者對扣碗酪產品多樣化的需要，此外，由于采用單一的米酒發酵，導致扣碗酪產品的發酵時間較長，不利于產品的工業化發展[2，4]。

迷迭香（Rosmarinus officinalis），屬于雙子葉植物，唇形科，迷迭香灌木，迷迭香作為香料，具有清甜帶松木香的氣息風味，香味濃烈，可廣泛應用于日常食品、功能食品、香料及調味品及化工等行業，被國際公認為第三代綠色食品添加劑[5-6]。此外，迷迭香提取物具有高效、無毒的抗氧化作用及多種生理功能，包括增強記憶力、鎮靜、安神醒腦，促進人心腦血管的血液循環，抑菌、治療消化不良和胃痛、調理皮膚油膩、刺激頭皮的毛發重新生長等[6-8]。雙歧桿菌（Bifidobacterium），是常見的發酵劑，且為人和動物腸道菌群主要的成員之一，具有抗腫瘤、潤腸通便、提高機體免疫力、延緩衰老、調節胃腸道平衡等多種生理功能，已經廣泛的應用在了發酵乳制品的研發中[9-14]。基于以上研究背景，可以考慮研制一款以雙歧桿菌為發酵劑，具有迷迭香風味的扣碗酪產品，從而解決扣碗酪產品單一，發酵時間過長的缺點。

本研究以迷迭香和全脂乳粉為主要的原料，采用雙歧桿菌進行發酵，以感官評分為評價指標，分析迷迭香和水的料液比、雙歧桿菌干粉添加量、米酒添加量和白砂糖加量對迷迭香雙歧桿菌扣碗酪（Rosmarinus officinalis Kouwan Lao fermented by Bifidobacterium，ROKLB）感官品質的影響，并利用正交試驗確定該產品的最佳配方。在此基礎上，利用Fenton反應法、鄰苯三酚自氧化法和DPPH比色法揭示迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）及1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）的清除效果，從而評價其抗氧化能力，為開發扣碗酪新產品提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

迷迭香（Rosmarinus officinalis）：河南省洛陽市；雙歧桿菌（Bifidobacterium）：東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室饋贈。

白砂糖、全脂乳粉、江米、安琪酒曲：洛陽大張超市；無水乙醇：蘇州科倫化工有限公司；鄰苯三酚：山東佰仟化工有限公司；硫酸亞鐵、鄰二氮菲：濟寧宏明化學試劑有限公司；DPPH、過氧化氫、氫氧化鈉：雄縣萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

GL124-1SCN電子天平：北京奧數儀器有限公司；LDZH-100KBS立式自動電熱蒸汽滅菌器：青島化工儀器設備有限公司；GZX-DH-300-BS-II 43L小容量電熱恒溫干燥-培養兩用箱：四川奧美儀器設備有限公司；BIOBASE超凈工作臺：深圳市藍思凈化科技有限公司；JHH6A精密數顯恒溫水浴鍋：常州朗越儀器制造有限公司；UPG-752分光-紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪的制備

根據蔡曉琳[15]的方法制備迷迭香雙歧桿菌扣碗酪，主要工藝流程如下：江米200 g→洗凈，浸泡2 h→鍋蒸30 min→冷卻到30℃左右→加入安琪酒曲（10%）→30℃培養3 d→濾液→得到米酒濾液（酒精度12%）；米酒濾液、迷迭香浸提液、白糖和雙歧桿菌加入到全脂乳粉中→42℃恒溫培養2.5 h左右→4℃后熟12 h。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 料液比對迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評定的影響

按照全脂奶粉為18%計算，依次以迷迭香∶水為0.5 ∶100、1 ∶100、1.5 ∶100、2 ∶100、2.5 ∶100（g/mL）按照工藝流程制備樣品，根據感官評定的結果分析迷迭香∶水對迷迭香雙歧桿菌扣碗酪品質的影響。

1.3.2.2 雙歧桿菌干粉添加量對迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評定的影響

按照全脂奶粉為18%計算，選取0.125%、0.2505%、0.375%、0.500%、0.625%的雙歧桿菌干粉添加量制備扣碗酪樣品，分析雙歧桿菌添加量對產品感官評定的影響。

1.3.2.3 米酒添加量對迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評定的影響

按照全脂奶粉為18%計算，選取14%、16%、18%、20%、22%的米酒濾液（體積比）比例制備樣品，分析米酒添加量對產品感官評定的影響。

1.3.2.4 白砂糖添加量對迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評定的影響

按照全脂奶粉為18%計算，選定1%、2%、3%、4%、5%的白砂糖添加量制備扣碗酪樣品，分析白砂糖添加量對產品感官評定的影響。

1.3.3 正交試驗

在單因素試驗基礎上，選取迷迭香水提液濃度、雙歧桿菌干粉添加量、米酒濾液添加量、白砂糖添加量4個因素進行產品配方的優化，因素水平表如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table

1.3.4 感官評定

對迷迭香雙歧桿菌的感官評定是從色澤、風味、組織狀態和口感這4個方面來進行分析，這4個方面占的分數分別為：15、25、25、35分，總分為 100分，感官評分表如2所示。

表2 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評價表Table 2 Sensory evaluation form of ROKLB

1.3.5 抗氧化活性分析

1.3.5.1 樣品預處理

以未添加迷迭香和雙歧桿菌的傳統扣碗酪（A組）、只添加迷迭香（B組）、只添加雙歧桿菌（C組）的扣碗酪產品作為對照，分別取10 g最優配方樣品（D組）和對照樣品，按照無水乙醇∶產品=1∶9體積比對產品進行稀釋，并將樣液混合均勻，放入離心機，轉速設置為4 000 r/min，時間為10 min。離心完成后，取上清液進行抗氧化活性試驗。

1.3.5.2 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對·OH清除能力的測定

采用Fenton反應法[16]測定產品上清液對羥基自由基的清除率。具體操作為：取系列干凈試管分別加入5 mmol/L的水楊酸-乙醇（95%）2 mL、10 mmol/L的FeSO41 mL，混勻，然后再向這些試管中分別添加空白待測液1 mL、樣品待測液1 mL、去離子水1 mL，再依次加10 mmol/L的H2O22 mL、10 mmol/L的 H2O22 mL和去離子水2 mL，最后使體積至25 mL，配置好溶液后，在水浴鍋設置37℃，然后計時30 min，在510 nm波長下測量吸光度值樣品反復測定3次，結果取平均[16]。依據下式計算·OH的清除率：

·OH 清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100

式中：A0為510 nm下無待測液的吸光度值；A1為510 nm下加待測液測得的吸光度值；A2為510 nm下加待測液不加H2O2測得的吸光度值。

1.3.5.3 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對O2-自由基清除能力的測定

采用鄰苯三酚自氧化法[17]測定迷迭香上清待測液對O2-的清除率。具體操作為：配pH 8.2的50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，3 mmol/L的鄰苯三酚（置于25℃的水浴鍋中）及樣品待測液和空白待測液備用。取4.5 mL的Tris-HCl緩沖液和4.2 mL的去離子水，混勻后放入恒溫水浴鍋中，在25℃的條件下保存20 min，再迅速加入0.3 mL預熱過的鄰苯三酸溶液，快速搖勻，在波長為325 nm處測定吸光度值，每30 s測一次，總共測10次。空白采用10 mmol/L的HCl溶液替代鄰苯三酚溶液。依據以下公式計算O2-自由基清除率：

O2-自由基清除率/%＝[1-（Vx/V0）]×100

式中：V0為325 nm下未加待測液吸光度值變化率；Vx為325 nm下加待測液吸光度值變化率。

1.3.5.4 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對DPPH自由基清除能力的測定

采用DPPH比色法[18]進行測定。具體操作為：取樣品待測液、空白待測液、0.2 mmol/L的DPPH－乙醇溶液。在測試管中依次加入體積均為2 mL的待測液和DPPH－乙醇溶液，在對照管中加入體積均為2 mL的待測液和無水乙醇，在空白管中加入體積均為2 mL的DPPH－乙醇溶液和無水乙醇。將以上混合溶液分別搖勻，在室溫下避光靜置30 min，在517 nm處測吸光度值，按照順序記為A1、A2、A0。樣品反復測 3次，結果取平均值。依據下式計算對DPPH自由基的清除率：

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1為517 nm下待測液和DPPH乙醇溶液的吸光度值；A2為517 nm下待測液和無水乙醇的吸光度值；A0為517 nm下無水乙醇和DPPH乙醇溶液的吸光度值。

1.3.6 數據分析

試驗中的數據以平均數±標準偏差的形式表示，利用SPSS20.0軟件中的Tukey’s檢驗對數據進行差異分析，當P＜0.05時視為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評定的影響

選取迷迭香浸提液∶水料液比為0.5∶100、1∶100、1.5 ∶100、2 ∶100、2.5 ∶100（g/mL），分析迷迭香浸取液濃度對產品感官品質的影響，結果如圖1所示。

圖1 料液比對迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評定的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on sensory evaluation of ROKLB

由圖1中可知，迷迭香與水料液比為1∶100（g/mL）時評分最高，此時產品色澤均勻，風味適中，當迷迭香與水料液比為0.5∶100（g/mL）時產品色澤淡黃，迷迭香香味風味不足，當迷迭香與水料液比為2.5∶100（g/mL）時迷迭香香味過重，影響產品整體風味。可見，迷迭香∶水的最佳料液比為1∶100（g/mL）。

2.1.2 雙歧桿菌干粉添加量對迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評定的影響

選取雙歧桿菌干粉添加量為0.125%、0.250%、0.375%、0.500%、0.625%，分析雙歧桿菌干粉添加量對產品感官品質的影響，結果如下圖2所示。

圖2 雙歧桿菌干粉添加量對迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評定的影響Fig.2 Effect of additive amount of Bifidobacterium powderon sensory evaluation of ROKLB

雙歧桿菌干粉添加量為0.375%時產品感官評分最高，添加量小于0.375%不利于扣碗酪的凝乳，產品有乳清析出的現象，大于0.375%產品的硬度較大，口感不細膩。可見雙歧桿菌干粉的最佳添加量為0.375%。

2.1.3 米酒添加量對迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評定的影響

選取米酒（酒精度12%vol）添加量為14%、16%、18%、20%、22%，分析米酒添加量對產品感官品質的影響，結果圖3所示。

圖3 米酒添加量對迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評定的影響Fig.3 Effect ofrice wineadditive amount on sensory evaluation of ROKLB

由圖3可知，米酒添加量為18%時扣碗酪感官評分最高為88分，當米酒添加量大于20%或者低于16%時產品感官評分在60分左右，此時乳清洗出嚴重。可見米酒的最佳添加量為18%。

2.1.4 白砂糖添加量對迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評定的影響

選取白砂糖添加量為1%、2%、3%、4%、5%，分析白砂糖添加量對產品感官品質的影響，結果如圖4所示。

圖4 白砂糖添加量對迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評定的影響Fig.4 Effect of sugar additive amount on sensory evaluation of ROKLB

當白砂糖添加量在2%時，感官評分最高為87分，說明白砂糖最佳的添加量為2%。

2.2 正交試驗

為了得到迷迭香雙歧桿菌扣碗酪的最佳組合，在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，并進行方法分析，結果如表3所示。

表3 正交試驗結果表Table 3 The orthogonal test results

由表3可知，影響迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官品質的主次順序為：雙歧桿菌干粉添加量（B）＞迷迭香∶水（料液比）（A）＞米酒添加量（C）＞白砂糖添加量（D），產品的最優組合為A2B1C3D2即迷迭香∶水為1∶100，雙歧桿菌干粉添加量0.250%，米酒添加量19%，白砂糖添加量2%。按照最優組合制備迷迭香雙歧桿菌扣碗酪。進行3次平行試驗，產品的感官評定得分分別為92、92、93，平均得分為92.33，高于正交試驗各組得分。方差分析見表4。

表4 正交試驗方差分析表Table 4 Anova table of orthogonal test

由表4可知，在4個因素中，迷迭香∶水（A）、雙歧桿菌干粉添加量（B）和米酒添加量（C）對迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官品質有顯著性影響（P＜0.05）。而白砂糖添加量（D）對產品的感官評定影響為不顯著（P＞0.05）。

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對·OH的清除作用

以未添加迷迭香和雙歧桿菌、只添加迷迭香、只添加雙歧桿菌的扣碗酪產品作為對照，分析最優迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對·OH的清除率，結果如圖5所示。

圖5 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對·OH的清除能力Fig.5 Ability of ROKLB to clear the·OH

由圖5可知，添加了迷迭香和雙歧桿菌扣碗酪（D組）對·OH的清除能力為69.85%，顯著高于其它3組對照樣品（P＜0.05）。此外只添加迷迭香（B組）和只添加雙歧桿菌（C組）的扣碗酪樣品對·OH的清除能力也有所提高，但與空白組相比并不顯著（P＞0.05）。可見迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對·OH清除能力的顯著提高是迷迭香和雙歧桿菌協同作用的結果。

2.3.2 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對O2-自由基的清除作用

取4組扣碗酪樣品（10 g），對其清除O2-自由基的能力進行測定，結果如圖6所示。

圖6 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對O2-自由基的清除能力Fig.6 Ability of ROKLB to clear the O2-radical

迷迭香雙歧桿菌扣碗酪（D組）對O2-自由基的清除率為42.31%，顯著高于其他3組扣碗酪樣品（P＜0.05）。此外，單獨添加迷迭香和雙歧桿菌均可以顯著提高扣碗酪對O2-自由基的清除能力（P＜0.05），但只添加迷迭香（B組）和只添加雙歧桿菌（C組）之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3.3 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對DPPH·的清除作用

以A組、B組和C組做對照組，分析迷迭香和雙歧桿菌的扣碗酪DPPH·清除能力的影響，結果如圖7所示。

圖7 迷迭香雙歧桿菌扣碗酪對DPPH·的清除能力Fig.7 Ability of ROKLB to clear the DPPH·

迷迭香雙歧桿菌扣碗酪（D組）對DPPH·的清除率為50.16%，顯著高于其他3組扣碗酪樣品（P＜0.05），說明迷迭香和雙歧桿菌的加入提高了扣碗酪對DPPH·的清除率。

3 結論

本研究利用單因素試驗和正交試驗優化了迷迭香雙歧桿菌扣碗酪的最優配方，即迷迭香∶水料液比為1∶100，雙歧桿菌干粉添加量0.250%，米酒添加量19%，白砂糖添加量2%。其中，迷迭香∶水料液比、雙歧桿菌干粉和米酒添加量對迷迭香雙歧桿菌扣碗酪感官評分有顯著性影響，而白砂糖添加量（D）對產品的感官評定影響不顯著。迷迭香雙歧桿菌扣碗酪抗氧化實驗結果表明迷迭香和雙歧桿菌的加入顯著提高了產品對·OH、O2-·和DPPH的清除能力。迷迭香雙歧桿菌扣碗酪中添加了食用型香料迷迭香和對人體有益生作用的雙歧桿菌，不僅豐富了扣碗酪產品的種類，而且雙歧桿菌的添加可以促進扣碗酪的凝乳，改善產品的質構特性，有利于扣碗酪產品的工業生產。此外，迷迭香和雙歧桿菌的添加提高了扣碗酪的抗氧化活性，而抗氧化活性是多種益生功能的基礎，因此本研究為功能性扣碗酪產品的研發提供了新的思路和理論依據。