響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取菜豆總黃酮工藝及對運(yùn)動大鼠心肌線粒體的影響

謝挺，趙暉

（1.河池學(xué)院，廣西河池547000；2.廣西大學(xué)，廣西南寧530004）

菜豆，別稱蕓豆，俗稱二季豆或四季豆，屬于薔薇科目菜豆屬的植物。菜豆目前在全世界進(jìn)行大面積的種植，菜豆作為最有營養(yǎng)價值的蔬菜種類之一[1]。菜豆主要包括食用纖維、礦物質(zhì)營養(yǎng)元素、維生素與植物營養(yǎng)素的重要來源[2]。每千克的菜豆含有葉綠素約為91.93 mg、VC約為 133 mg、有機(jī)酸約為 172 mg、蛋白質(zhì)含量很高達(dá)到4.27%、總糖含量為3.12%，所以具有很高的食用價值[3]。長期食用菜豆可以起到提高免疫力、提升血管彈性、增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力、增強(qiáng)心臟功能、平衡血糖等作用。另外，菜豆中還含有黃酮類化合物具有增強(qiáng)免疫、抗病毒、抗氧化能力等作用[4]。目前對菜豆的研究很少，大部分的了解僅僅處在基本的營養(yǎng)成分方面，并且菜豆在食用過程中時常有中毒情況發(fā)生，使得大眾對于菜豆的認(rèn)識較為片面。

當(dāng)前還沒有利用響應(yīng)面法來提取菜豆總黃酮的相關(guān)報道，為此本文采用微波輔助法來提取菜豆總黃酮，利用響應(yīng)面法優(yōu)化出一種提取菜豆總黃酮的最佳工藝，并且對運(yùn)動大鼠進(jìn)行灌胃處理，探討菜豆總黃酮對運(yùn)動大鼠心肌線粒體的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

菜豆：新農(nóng)部落生鮮專營店；乙醇（分析純）：天津科密歐試劑有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase from micrococcus lysodeikticus，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒：上海紀(jì)寧實業(yè)有限公司；SPF級雄性SD大鼠50只，體重在（200±5）g：蘇州西山中科實驗動物有限公司（SYXK（蘇）2012-0009）。

1.2 儀器與設(shè)備

Xinyi-2A型微波超聲波萃取儀：寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；WK-150型粉碎機(jī)：山東精誠醫(yī)藥裝備有限公司；J-SKY型電子天平：昆山巨天儀器設(shè)備有限公司；DFY-200C型粉碎機(jī)：上海利聞科學(xué)儀器有限公司；UV759型紫外可見分光光度計：青島聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司；AYDHG-101A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：江蘇安盈環(huán)境設(shè)備有限公司；ZH-PT型實驗跑臺：安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菜豆總黃酮的提取

將菜豆放置于55℃的烘箱中干燥150 min之后，將其粉碎，使用100目篩選取粒徑為≤0.15 mm的粉末備用。稱量若干菜豆粉末，并且將其放入三角瓶中，加入一定量的乙醇浸泡60 min。將其放入到微波超聲萃取儀中，按照預(yù)先設(shè)定的時間、溫度、功率進(jìn)行提取，待提取完成之后，趁熱進(jìn)行過濾，將濾液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，用50%乙醇溶液定容。按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定其吸光度，并且將得到的吸光度值代入到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，從而計算菜豆中總黃酮的濃度，并用總黃酮的提取率公式計算提取率[5]。

式中：Y為菜豆總黃酮提取率，%；C為提取液的濃度，mg/mL；V為樣品溶液的體積，mL；N為稀釋的倍數(shù)；M為菜豆粉末的質(zhì)量，g。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取在120℃下干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品30.12 mg，并且將其放入到100 mL燒杯中加入50%乙醇溶液溶解，并且轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，搖勻，將其配置成濃度為0.6 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。并精密量取配置完成的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，分別加入5%硝酸鈉溶液0.3 mL，靜置7 min。加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，靜置7 min。加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，最后用50%乙醇溶液定容至刻度，靜置20 min后，分別在510 nm處測定其吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)（x），以吸光度為縱坐標(biāo)（y），得到線性回歸方程為y=2.343x-0.009（R2=0.999 2），表明線性關(guān)系良好，可信度較高[6]。

1.3.3 菜豆總黃酮提取單因素試驗

1.3.3.1 液料比對菜豆總黃酮提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、微波時間16 min、微波功率為300 W、提取溫度為50℃的條件下，設(shè)定不同液料比為 10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g），測定提取液的吸光度，計算菜豆總黃酮提取率。

1.3.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對菜豆總黃酮提取率的影響

在液料比為 20 ∶1（mL/g）、微波時間 16 min、微波功率為300 W、提取溫度為50℃的條件下，設(shè)定不同乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%，測定提取液的吸光度，計算菜豆總黃酮提取率。

1.3.3.3 微波時間對菜豆總黃酮提取率的影響

在液料比為20∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、微波功率為300 W、提取溫度為50℃的條件下，設(shè)定不同微波時間為 8、12、16、20、24 min，測定提取液的吸光度，計算菜豆總黃酮提取率。

1.3.3.4 微波功率對菜豆總黃酮提取率的影響

在液料比為20∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、微波時間16 min、提取溫度為50℃的條件下，設(shè)定不同微波功率為 200、250、300、350、400 W，測定提取液的吸光度，計算菜豆總黃酮提取率。

1.3.3.5 提取溫度對菜豆總黃酮提取率的影響

在液料比為20∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、微波時間16 min、微波功率為300 W的條件下，設(shè)定不同提取溫度為 40、45、50、55、60 ℃，測定提取液的吸光度，計算菜豆總黃酮提取率。

1.3.4 動物分組與運(yùn)動方案

選取SPF級雄性SD大鼠50只，體重在（200±5）g，隨機(jī)分成5組，每個小組10只大鼠，分成對照組、運(yùn)動組、低、中、高劑量菜豆總黃酮組。其中對照組不進(jìn)行任何運(yùn)動，其它4組進(jìn)行跑步訓(xùn)練，時間持續(xù)4周。低、中、高劑量菜豆總黃酮組每天按劑量分別灌胃菜豆總黃酮80、160、240 mg/kg，運(yùn)動組灌胃生理鹽水 160 mg/kg。

運(yùn)動方案：將大鼠放置在跑臺上進(jìn)行訓(xùn)練，每組大鼠進(jìn)行5°，20 m/min，直至大鼠力竭。判斷力竭狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)，使用毛刷刺激大鼠尾部，如果大鼠跑動速度與預(yù)設(shè)速度出現(xiàn)差距，并且其臀部壓在跑臺上，大鼠的后肢跟隨轉(zhuǎn)動跑臺的皮帶后拖達(dá)到20 s，則視為大鼠處在力竭狀態(tài)[7]。大鼠在4周實驗結(jié)束之后，采集大鼠血液，并對相關(guān)指標(biāo) SOD、GSH-Px、MDA、CAT 含量根據(jù)酶學(xué)試劑盒的說明書檢測分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

本文使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，采取組間進(jìn)行對比，P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對菜豆總黃酮提取率的影響

液料比對菜豆總黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 液料比對菜豆總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on extraction rate of total flavonoids from kidney bean

根據(jù)圖1分析得出，隨著液料比的增加，菜豆總黃酮提取率逐漸提高，當(dāng)液料比達(dá)到25∶1（mL/g）時，提取率達(dá)到最高。繼續(xù)增加液料比，提取率反而稍有下降的趨勢。可能因為液料比的增加，使得溶劑與提取物接觸的更加充分，但是液料比過大時，體系中可能出現(xiàn)其他可溶性的雜質(zhì)與黃酮競爭溶劑，從后續(xù)處理的便捷性以及節(jié)約成本來考量，選擇液料比為25∶1（mL/g）更為合適[8]。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對菜豆總黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對菜豆總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對菜豆總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of total flavonoids from kidney bean

根據(jù)圖2分析得出，在乙醇體積分?jǐn)?shù)40%～60%之間，菜豆總黃酮提取率是逐漸上升的，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%時，提取率達(dá)到最高。但是在60%～80%之間，菜豆總黃酮提取率反而降低。首先隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，有利于樣品的提取，但是溶劑一旦超過一定的濃度就會導(dǎo)致樣品中其他親脂性成分溶出，影響菜豆總黃酮的溶解度[9]。

2.1.3 微波時間對菜豆總黃酮提取率的影響

微波時間對菜豆總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 微波時間對菜豆總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of microwave time on extraction rate of total flavonoids from kidney bean

根據(jù)圖3分析得出，隨著時間的延長，菜豆總黃酮提取率逐漸提高，當(dāng)微波時間達(dá)到16 min時，提取率達(dá)到最高，之后繼續(xù)延長時間，提取率變化不大。可能是因為微波時間短時菜豆總黃酮溶出不完全。但是微波時間過長會導(dǎo)致菜豆總黃酮結(jié)構(gòu)遭到破壞，造成不必要的浪費[10]。

2.1.4 微波功率對菜豆總黃酮提取率的影響

微波功率對菜豆總黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 微波功率對菜豆總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of microwave power on extraction rate of total flavonoids from kidney bean

根據(jù)圖4分析得出，隨著微波功率的增加，菜豆總黃酮提取率逐漸升高，當(dāng)微波功率為350 W時，菜豆總黃酮提取率達(dá)到最大。繼續(xù)升高微波功率，菜豆總黃酮提取率開始降低。這是因為微波功率較低時，菜豆細(xì)胞的破壁程度較低，導(dǎo)致菜豆總黃酮溶出量較少，隨著微波功率的逐漸增加，破壁能力增加，溶出效果增加，但是微波功率繼續(xù)增加，會使溶劑的揮發(fā)速度增加，同時也增加了總黃酮的降解速度，導(dǎo)致菜豆總黃酮提取率下降[11]。

2.1.5 提取溫度對菜豆總黃酮提取率的影響

提取溫度對菜豆總黃酮提取率的影響見圖5。

圖5 提取溫度對菜豆總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids from kidney bean

根據(jù)圖5分析得出，菜豆總黃酮提取率表現(xiàn)為先升高后降低的狀態(tài)，菜豆總黃酮提取率在50℃時達(dá)到最高。可能是因為溫度的提升使得菜豆中的總黃酮溶解度升高，使得提取率上升，一旦溫度繼續(xù)上升，菜豆中其他的親脂性物質(zhì)就會溶出，影響總黃酮的提取率。

2.2 響應(yīng)面法試驗工藝設(shè)計表及結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面法試驗工藝設(shè)計表

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過菜豆總黃酮提取率（Y）為指標(biāo)，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、微波功率（X2）和微波溫度（X3）3個對菜豆總黃酮提取影響較大的因素，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗設(shè)計，采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計的Box-Behnken試驗，試驗因素與水平見表1。

2.2.2 試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定各因素最佳水平值范圍，響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平Table 1 Box-Behnken test design factor level

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken test design and results

利用Design-Expert 8.0軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多元回歸方程：

Y=2.43 ＋0.048X1-0.040X2＋0.033X3-0.013X1X2＋0.038X1X3-0.082X2X3-0.36X12-0.15X22-0.16X32

回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面回歸模型ANOVA分析結(jié)果Table 3 Response surface regression model ANOVA analysis results

續(xù)表3 響應(yīng)面回歸模型ANOVA分析結(jié)果Continue table 3 Response surface regression model ANOVA analysis results

由表3的ANVOA分析可知：模型P=0.000 1＜0.01（極顯著），失擬項 P=0.889 9＞0.05（不顯著），說明方程對試驗具有較好的擬合性，試驗誤差較小。相關(guān)系數(shù)R2=0.992 8，調(diào)整系數(shù)Adj.R2=0.983 5也表明模型擬合程度較好。說明該模型適合菜豆總黃酮的提取。

通過表3分析可知，對菜豆總黃酮提取率影響次序為：乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）＞ 微波功率（X2）＞ 微波溫度（X3）。并且乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、微波功率（X2）影響都達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），微波溫度（X3）達(dá)到了顯著水平；X1X3達(dá)到顯著水平（P＜0.05）、X2X3達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、微波功率（X2）和微波溫度（X3）各因素的二次項對菜豆總黃酮提取率影響極顯著（P＜0.01）。

2.2.3 響應(yīng)面分析最佳工藝方案

圖6表示乙醇體積分?jǐn)?shù)與微波溫度對提取率的影響。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與微波溫度對提取率的響應(yīng)面分析Fig.6 Response surface analysis of ethanol volume fraction and microwave temperature on extraction rate

分析可得，乙醇體積分?jǐn)?shù)與微波溫度對提取率的影響是明顯的。由于3D曲面陡峭，同時兩者之間交互作用明顯，等高線接近橢圓形。圖7表示微波功率與微波溫度對提取率的影響。

圖7 微波功率與微波溫度對提取率的響應(yīng)面分析Fig.7 Response surface analysis of microwave power and microwave temperature on extraction rate

分析可得，微波功率與微波溫度對提取率的影響是顯著的。由于3D曲面陡峭，同時兩者之間交互作用顯著，等高線呈橢圓形。

通過上述分析得菜豆總黃酮提取率最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）為 60.69%、微波功率（X2）為355.26 W、微波溫度（X3）為50.42℃時菜豆總黃酮提取率為2.44%。考慮到實際情況方便操作稍作調(diào)整，采用乙醇體積分?jǐn)?shù)為61%、微波功率為355 W、微波溫度為50℃時，進(jìn)行3次平行試驗，以驗證工藝的穩(wěn)定性，實際得出的菜豆總黃酮平均提取率為2.43%，與理論值相比誤差較小，表明該方案適合用來提取菜豆總黃酮。

2.3 菜豆總黃酮對運(yùn)動大鼠心肌線粒體的影響

菜豆總黃酮對運(yùn)動大鼠心肌線粒體的影響見表4。

表4 菜豆總黃酮對運(yùn)動大鼠心肌線粒體的影響Table 4 Effects of total flavonoids of kidney bean on myocardial mitochondria in exercise rats

由表4得出，運(yùn)動組與對照組相比SOD活性明顯降低（P＜0.05），高劑量組的SOD活性與對照組相比不具有顯著性差異（P＞0.05），高劑量組的SOD活性與運(yùn)動組相比明顯增加（P＜0.05）；運(yùn)動組與對照組相比CAT活性明顯降低（P＜0.05），高劑量組的CAT活性與對照組相比不具有顯著性差異（P＞0.05），高劑量組CAT活性與運(yùn)動組相比明顯增加（P＜0.05）；運(yùn)動組與對照組相比GSH-Px活性明顯降低（P＜0.05），高劑量組的GSH-Px活性與對照組相比不具有顯著性差異（P＞0.05），高劑量組GSH-Px活性與運(yùn)動組相比明顯增加（P＜0.05）。長期的力竭運(yùn)動可以使心肌線粒體內(nèi)的抗氧化酶 （SOD、GSH-Px、CAT） 活性降低，SOD、GSH-Px、CAT具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)[12]。菜豆總黃酮具有抗氧化能力，可以提高SOD、GSH-Px、CAT 3種酶的活性，抑制力竭運(yùn)動造成的心機(jī)線粒體的損傷。

運(yùn)動組與對照組相比MDA含量明顯提高（P＜0.05），其中高劑量組的MDA含量與對照組相比不具有顯著性差異（P＞0.05），高劑量組的MDA含量與力竭運(yùn)動組相比明顯降低（P＜0.05）。MDA是不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其具有細(xì)胞毒性，對機(jī)體細(xì)胞有嚴(yán)重?fù)p傷作用[13]。菜豆總黃酮可以刺激抗氧化酶的活性，降低MDA對機(jī)體細(xì)胞損傷的影響。

3 結(jié)論

采取響應(yīng)面法提取菜豆總黃酮優(yōu)化出的工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為60.69%、微波功率為355.26 W、微波溫度為50.42℃時菜豆總黃酮提取率為2.44%。考慮到實際情況方便操作稍作調(diào)整，采用乙醇體積分?jǐn)?shù)為61%、微波功率為355 W、微波溫度為50℃時，進(jìn)行3次平行試驗，以驗證工藝的穩(wěn)定性，實際得出的菜豆總黃酮平均提取率為2.43%，與理論值相比誤差較小，表明該方案適合用來提取菜豆總黃酮。同時，通過對大鼠灌胃菜豆總黃酮研究其對大鼠心肌線粒體的影響，表明菜豆總黃酮具有良好的抗氧化能力，起到清除自由基的作用，進(jìn)而對心肌線粒體起到保護(hù)作用。