超聲波輔助提取青梅有機(jī)酸及其成分分析

凌志洲，夏雨，曾榮，魯旺旺，白衛(wèi)東，白永亮，，*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山528000；2.咀香園健康食品（中山）有限公司，廣東中山528437；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225）

青梅（Prunus mume Sieb.Et Zucc），俗稱酸梅、果梅或干枝梅，屬薔薇科李屬，多年生落葉果樹，屬于藥食兩用果品[1]；果肉中含有多種谷甾醇、抗菌性多酚、黃酮類、有機(jī)酸、維生素以及鉀、鈣、鐵、磷、鋅等礦物質(zhì)；同時(shí)富含18種氨基酸，其中8種為人體必需氨基酸[2-5]。青梅最大營(yíng)養(yǎng)特色是含有豐富而優(yōu)質(zhì)的有機(jī)酸，含量一般在3.0%～6.5%，遠(yuǎn)高于一般水果，且糖含量較低，其T值（糖酸比）僅為0.2，是梨的1/70，杏的1/8，比檸檬的T值還低[6]。其所含的有機(jī)酸主要為檸檬酸、蘋果酸、單寧酸、苦葉酸、琥珀酸、酒石酸等[7-8]，具有生津解渴，改善消化不良、食欲不振等癥狀；且具有消除疲勞、改善堿性體質(zhì)、促進(jìn)皮膚角質(zhì)層代謝、防止皺紋、抗腫瘤、改善腸胃功能、抗菌、抗過(guò)敏、保護(hù)肝臟等功效[9-13]，在醫(yī)藥領(lǐng)域和食品領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。

但由于青梅略帶苦澀的口感欠佳，在我國(guó)極少鮮食，多見(jiàn)用于開發(fā)傳統(tǒng)的初級(jí)加工制品，例如苷草梅、話梅和酥梅等，延長(zhǎng)貨架期。近年來(lái)，利用青梅開發(fā)的深加工產(chǎn)品較少，主要是青梅酒[14]，還有包括青梅果脯、青梅酸奶、青梅汁、青梅果凍等[15-18]，未見(jiàn)針對(duì)于青梅特征成分豐富的有機(jī)酸的開發(fā)利用報(bào)道。根據(jù)王玉霞等[19]研究報(bào)道，新鮮青梅的含水量高達(dá)88%以上，同時(shí)新鮮青梅有機(jī)酸含量為6%左右，直接用于提取制備富含青梅有機(jī)酸的青梅香酊等深加工產(chǎn)品工藝難度較大。目前對(duì)青梅有機(jī)酸的提取工藝研究報(bào)道也較少，只有魯旺旺等[20]采用低溫酶解輔助乙醇浸提法提取了經(jīng)微波處理干制后青梅果肉中的有機(jī)酸，尚未見(jiàn)關(guān)于超聲波輔助浸提青梅中有機(jī)酸的研究報(bào)道。對(duì)于絕大部分水果而言，由于香味揮發(fā)性物質(zhì)含量較低，無(wú)法實(shí)現(xiàn)水油兩相的分離，存在于水相中的香味揮發(fā)物無(wú)法直接用于香精的調(diào)配。因此，如何控制提取工藝，進(jìn)而進(jìn)行香味成分分離濃縮，是調(diào)配水果香韻香精必須解決的一個(gè)問(wèn)題。

本試驗(yàn)采用經(jīng)微波干燥處理后的干制青梅果肉為原料提取青梅有機(jī)酸，運(yùn)用超聲波技術(shù)輔助提取，制得有機(jī)酸含量高和香氣成分保留率高的青梅有機(jī)酸提取液，并采用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC） 和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS）分析對(duì)提取液中有機(jī)酸和香氣特征成分進(jìn)行分析。該產(chǎn)品可以進(jìn)一步濃縮制備青梅香酊，或用于各類食品中，具有良好的開發(fā)前景，使青梅深加工產(chǎn)業(yè)得到進(jìn)一步的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 原料與設(shè)備

青梅：微波干燥產(chǎn)品，四川綿陽(yáng)天眾中藥材有限公司；果膠酶（Pectinex XXL，酶活力 10 000 U/mL）、纖維素酶（酶活力561.7 U/mL）：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司。

LC-10AT高效液相色譜儀：日本島津；TRACE GCMS氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)Finnigan公司；SHZ-D（Ⅲ）防腐臺(tái)式循環(huán)水真空泵：上海衛(wèi)凱儀器設(shè)備有限公司；SB-400 DTY超聲波儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；752N紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

1.2.1.1 乙醇回流工藝

干制青梅果肉→粉碎過(guò)篩→乙醇回流提取→抽濾→有機(jī)酸測(cè)定。

提取條件為：回流時(shí)間4 h，乙醇濃度70%，料液比 1 ∶10（g/mL），回流溫度 85℃[20]。

1.2.1.2 超聲提取工藝

干制青梅果肉→粉碎過(guò)篩→酶解→超聲波提取→抽濾→有機(jī)酸測(cè)定。

1.2.2 超聲波提取工藝的單因素條件分析

1.2.2.1 超聲時(shí)間對(duì)有機(jī)酸提取效果的影響

取5 g干制青梅粉加入適量水50℃酶解1 h，后加入70%乙醇，料液比1∶10（g/mL），搖勻置于超聲波儀中，超聲功率320 W，超聲溫度30℃，分別超聲提取0、10、20、30、40 min，測(cè)定不同超聲提取時(shí)間對(duì)總有機(jī)酸得率的影響。

1.2.2.2 超聲功率對(duì)有機(jī)酸提取效果的影響

取5 g干制青梅粉加入適量水50℃酶解1 h，后加入70%乙醇，料液比1∶10（g/mL），搖勻置于超聲波儀中，依次調(diào)節(jié)超聲功率 0、80、160、240、320、400 W，超聲溫度30℃，分別超聲提取20 min，測(cè)定不同超聲功率對(duì)總有機(jī)酸得率的影響。

1.2.2.3 超聲溫度對(duì)有機(jī)酸提取效果的影響

取5 g干制青梅粉加入適量水50℃酶解1 h，后加入70%乙醇，料液比1∶10（g/mL），搖勻置于超聲波儀中，超聲功率 320 W，超聲溫度依次為 30、40、50、60、70、80℃，超聲提取20 min，測(cè)定不同超聲溫度對(duì)總有機(jī)酸得率的影響。

1.2.2.4 超聲料液比對(duì)有機(jī)酸提取效果的影響

取5 g干制青梅粉加入適量水50℃酶解1 h，后加入 70%乙醇，依次調(diào)節(jié)料液比 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），搖勻置于超聲波儀中，超聲功率320 W，超聲溫度為30℃，超聲提取20 min，測(cè)定不同超聲料液比對(duì)總有機(jī)酸得率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，將干制青梅粉加入適量水50℃酶解1 h，后加入70%乙醇，搖勻置于超聲波儀中，選用四因素三水平的正交試驗(yàn)方案，確定有機(jī)酸提取的最佳工藝參數(shù)。其因素、水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)參數(shù)及水平Table 1 Orthogonal test parameters and levels

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 干制青梅果肉總有機(jī)酸含量的測(cè)定

干制青梅果肉總有機(jī)酸含量的測(cè)定參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》。

1.3.2 HPLC測(cè)定青梅有機(jī)酸提取液成分分析

取兩種不同方式的青梅有機(jī)酸提取液，經(jīng)5000r/min離心10 min，上清液用0.45 μm孔徑濾膜過(guò)濾，濾液進(jìn)行HPLC分析。色譜柱條件：Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A（甲醇），B（0.01mol/L KH2PO4（pH2.85）水溶液）；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm；溫度：20℃；進(jìn)樣量：10 μL。8種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖如圖1所示，回歸分析和檢出限如表2所示。

1.3.3 GC/MS測(cè)定青梅有機(jī)酸提取液香氣分析

圖1 8種有機(jī)酸標(biāo)譜Fig.1 Standard chromatogram of 8 organic acids

表2 8種有機(jī)酸回歸分析和檢出限Table 2 Regression analysis and detection limit of 8 organic acids

色譜條件：彈性石英毛細(xì)管柱上DB-5（30 m×0.25 mm）；程序升溫，柱溫起始溫度45℃進(jìn)樣后停5 min，然后以5℃/min升至80℃停5 min，然后再以5℃/min升至200℃，進(jìn)樣口溫度200℃；載氣為高純氦氣，流量為1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：EI源，源溫230℃，加速電壓6 kV，電子能量 70 V，源真空 5×10-4Pa，分析器真空 1×10-6Pa。質(zhì)量分析器四極桿150℃，掃描質(zhì)量數(shù)m/z 35～335，掃描時(shí)間15 s，回掃時(shí)間0.025 s。取1 μL制備好的樣品進(jìn)色譜，進(jìn)行GC/MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助提取工藝單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響

超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.2 The influence of ultrasonic time on the extraction effect

由圖2可知，超聲時(shí)間從0到20 min青梅果肉（干重）總有機(jī)酸得率逐漸提高，20 min時(shí)得率最高提取效果最好；20 min后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)得率略有下降，但差異不顯著，與龐榮麗等[21]研究結(jié)果相似。由于超聲波作用時(shí)間的增加導(dǎo)致溶劑溫度上升，增加其他成分的溶解，延長(zhǎng)提取時(shí)間會(huì)產(chǎn)生大量殘?jiān)灰走^(guò)濾，影響總有機(jī)酸的提取得率及進(jìn)一步的分離。且考慮到提取周期，選擇20 min為最佳提取時(shí)間。

2.1.2 超聲功率對(duì)提取效果的影響

超聲功率對(duì)提取效果的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲功率對(duì)有機(jī)酸提取效果的影響Fig.3 The effect of ultrasonic power on the extraction of organic acids

由圖3可得，超聲功率低于320 W時(shí)，總有機(jī)酸得率隨著超聲功率的增大而增大；當(dāng)功率高于320 W時(shí)，得率整體趨于平緩。提取包括擴(kuò)散、滲透、溶解等過(guò)程，提取功率愈大，提取愈完全，但當(dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡時(shí)，增大超聲功率，得率不再增大[22]，故選擇320 W為最佳超聲功率。

2.1.3 超聲溫度對(duì)提取效果的影響

超聲溫度對(duì)提取效果的影響見(jiàn)圖4。

圖4 超聲溫度對(duì)提取效果的影響Fig.4 The effect of ultrasonic temperature on the extraction effect

由圖4可得，溫度對(duì)總有機(jī)酸得率的影響較明顯。研究表明，隨著溫度升高液體介質(zhì)的表面張力和黏度降低，而液體的蒸汽壓則增加，這樣在液體介質(zhì)之間很容易拉開而形成空化氣泡，從而在較低超聲波強(qiáng)度下即可產(chǎn)生空化作用[23]。空化作用使得細(xì)胞破壞程度增大，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)部的有機(jī)酸物質(zhì)向外擴(kuò)散。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著溫度升高總有機(jī)酸得率迅速提高，在60℃時(shí)有機(jī)酸得率達(dá)到最高；高于60℃后，總有機(jī)酸得率不再顯著提高。同時(shí)可能隨著溫度的升高青梅的香氣損失就會(huì)增大，由此選取60℃為最佳超聲溫度。

2.1.4 不同料液比對(duì)提取效果的影響

料液比對(duì)提取效果的影響見(jiàn)圖5。

圖5 料液比對(duì)提取效果的影響Fig.5 The influence of liquid ratio on extraction effect

由圖5可得，隨著提取溶劑體積增大，總有機(jī)酸得率呈先顯著提高后緩慢降低的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶10（g/mL）時(shí)得率最高。可能因?yàn)榧尤氲娜軇┝可伲鳛槌暡ń橘|(zhì)的液體量不足，導(dǎo)致提取效果較差；隨著提取溶劑量的增大，細(xì)胞內(nèi)部的有機(jī)酸開始向外擴(kuò)散，此時(shí)總有機(jī)酸的得率也隨之增大。當(dāng)料液比在1 ∶10（g/mL）～1 ∶25（g/mL）之間時(shí)，總有機(jī)酸得率呈下降趨勢(shì)，但趨勢(shì)不明顯。考慮到提取的溶劑量過(guò)大時(shí)會(huì)增加后續(xù)濃縮處理的工作量和能耗，不利于實(shí)際操作和生產(chǎn)，從成本考慮選定1∶10（g/mL）為最佳提取料液比。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

超聲波輔助提取青梅有機(jī)酸正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果及方差分析見(jiàn)表3和表4。

表3 超聲波輔助提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Ultrasonic extraction of orthogonal test results

表4 方差分析表Table 4 Variance analysis table

表3結(jié)果表明，超聲時(shí)間對(duì)干制青梅果肉總有機(jī)酸得率的影響程度最大，超聲功率次之，超聲溫度和料液比的影響較小；最佳提取條件為A2B2C3D3，即超聲溫度為70℃，超聲功率320 W，超聲時(shí)間為20 min，料液比1∶15（g/mL）。為進(jìn)一步判斷4個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響是否顯著，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。由表4可以看出，超聲時(shí)間、超聲功率對(duì)青梅中有機(jī)酸提取效果影響顯著。

為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)的可靠性，根據(jù)實(shí)際情況采用最優(yōu)工藝條件（超聲時(shí)間20 min，超聲溫度70℃，超聲功率320 W，料液比1∶15（g/mL））進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。經(jīng)過(guò)3次平行試驗(yàn)，實(shí)際總有機(jī)酸提取得率的平均值為35.07%，與正交試驗(yàn)表中最大值接近，表明該提取工藝基本穩(wěn)定、可行。相比乙醇回流提取總有機(jī)酸得率（31.2%）顯著提高，與魯旺旺等[20]采用酶解法提取有機(jī)酸得率相比，沒(méi)有明顯差異，但超聲提取的時(shí)間比酶解浸提大大縮短。

2.3 青梅提取液中有機(jī)酸和香氣成分分析

青梅提取液的特色之處在于其含有豐富的有機(jī)酸和天然獨(dú)特的果香味，可以將有機(jī)酸和其天然香氣作為衡量產(chǎn)品的主要指標(biāo)。本文以傳統(tǒng)乙醇回流提取工藝作為對(duì)比，研究超聲波輔助提取工藝對(duì)有機(jī)酸和香氣成分的影響。

2.3.1 有機(jī)酸成分分析

乙醇回流及超聲輔助提取青梅提取液中主要有機(jī)酸的含量見(jiàn)圖6和圖7。

圖6 不同工藝提取液中主要有機(jī)酸的含量Fig.6 Main organic acid content of different extract

圖7 不同工藝提取液中主要有機(jī)酸含量Fig.7 Main organic acid content of different extract

試驗(yàn)對(duì)青梅提取液中8種主要有機(jī)酸的含量進(jìn)行測(cè)定。由圖6和7可得，青梅有機(jī)酸中以檸檬酸和蘋果酸為主，這與Yu等[24]的研究結(jié)果一致。超聲輔助提取液中檸檬酸和蘋果酸含量顯著高于乙醇回流提取，可能是由于這兩種有機(jī)酸受溫度影響較大所致[25]。乙醇回流提取液中易揮發(fā)的乳酸和乙酸損失嚴(yán)重，基本檢測(cè)不出。試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波輔助提取工藝對(duì)青梅主要有機(jī)酸種類保留較好，總有機(jī)酸得率較高，提取效果最好。

2.3.2 香氣成分分析

乙醇回流及超聲輔助提取青梅提取液中香氣成分GC/MS分析結(jié)果見(jiàn)表5，及其不同種類的香氣百分含量見(jiàn)圖8。

表5 提取液香氣成分GC/MS分析結(jié)果Table 5 GC/MS analysis results of extract aroma composition

續(xù)表5 提取液香氣成分GC/MS分析結(jié)果Continue table 5 GC/MS analysis results of extract aroma composition

圖8 兩種提取液主要香氣種類的比較Fig.8 Comparison of the main aroma types of three extracts

從表5統(tǒng)計(jì)結(jié)果可見(jiàn)，乙醇回流提取液香氣成分鑒定出37種，超聲輔助提取液中香氣成分也鑒定出37種，但各種香氣的成分含量存在顯著差異。與青梅汁和青梅酒等產(chǎn)品相比，青梅有機(jī)酸提取液的香氣種類更為豐富[26]。提取液香氣成分含量較高的是一些酸類，主要是棕櫚酸、亞油酸、衣康酸酐、檸檬酸等，這些酸類物質(zhì)賦予青梅獨(dú)特的酸香味。在香氣種類方面，乙醇回流提取液共檢測(cè)出酸類7種，脂類11種，醇類3種，醛類5種和烷烴5種；超聲輔助提取液共檢測(cè)出酸類14種，脂類4種，醛類5種和烷烴5種。

由圖8可知，超聲輔助提取液中酸類等香氣成分相對(duì)含量顯著高于乙醇回流提取液，特征香氣亞油酸和棕櫚酸等相對(duì)含量都有較大程度的提高，香氣成分保留率明顯較好。乙醇回流提取液香氣種類也比較豐富，特別是酯類，但相對(duì)含量較少，這可能因?yàn)樵陂L(zhǎng)時(shí)間的加熱回流條件下，一些有機(jī)酸和醇酯化生成了一些酯類香氣，從而改變了提取液天然的香氣成分。醛類和酯類物質(zhì)作為新鮮青梅主要的呈香物質(zhì)[27]，相比乙醇回流提取，超聲輔助提取能較好的保留酯類和醛類物質(zhì)。而相對(duì)于新鮮青梅，提取液中酯類物質(zhì)的減少，可能是在干燥或提取過(guò)程中分解生成了醇類和酸類導(dǎo)致。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取工藝，結(jié)果表明超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)干制青梅果肉總有機(jī)酸得率的影響程度最大，超聲溫度和料液比的影響相對(duì)較小。確定最佳提取條件為：超聲溫度70℃，超聲時(shí)間 20 min，料液比 1∶15（g/mL），超聲功率 320 W。在此條件下干制青梅果肉總有機(jī)酸提取得率為35.07%，相比傳統(tǒng)乙醇回流提取總有機(jī)酸得率（31.2%）顯著提高。

由HPLC分析8種有機(jī)酸結(jié)果可知，干制青梅果肉提取液有機(jī)酸種類以檸檬酸和蘋果酸為主，成分流失較少；相比乙醇回流提取，超聲輔助提取有機(jī)酸的種類和含量更多，乙醇回流提取液中易揮發(fā)的乳酸和乙酸基本鑒定不出，超聲輔助提取能很好的保留檸檬酸（33.06%）和蘋果酸（2.038%）。由GC/MS分析結(jié)果可知，提取液主要特征香氣成分為酸類物質(zhì)，酯類和醛類物質(zhì)含量次之；超聲輔助提取液特征酸性香氣的含量顯著高于乙醇提取液。