響應面法優化洋蔥多酚的提取工藝及抗氧化性研究

（漯河食品職業學院食品工程系，河南漯河462000）

洋蔥，人們常稱為球蔥、蔥頭、玉蔥或者皮牙子，是生長周期兩年的草本科植物，是一種性價比非常高的蔬菜，也是調味料的主要成分[1]。洋蔥中的營養成分含量非常可觀，鉀、維生素C、葉酸、鋅、硒、植物多酚及纖維質等常規營養物質與他蔬菜相比含量較高，更令科學家驚喜的是槲皮素和前列腺素A這兩種生理活性物質在洋蔥中的含量也比較高，這兩種物質使洋蔥具有了許多獨特的保健功能[2]。

洋蔥含有大量的多酚類化合物，對其的提取研究目前已經出現的有超高壓提取法、乙醇浸提法、微波輔助提取法等，但用超聲波輔助提取洋蔥多酚的方法還少有報道。本研究擬考察通過單因素試驗分別探討超聲功率、超聲處理時間、乙醇濃度、固液比4個單因素對洋蔥多酚得率的影響；在單因素試驗基礎上，依據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理[3]，設計四因素三水平的響應面法分析試驗，確定超聲輔助提取洋蔥多酚的最佳提取條件。并對得到的多酚物質進行體外抗氧化活性分析，對洋蔥的綜合利用和開發提供一定的試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

新鮮紫皮洋蔥：漯河千盛購物廣場；

福林酚試劑：天津華特化科技有限責任公司；沒食子酸、三羥基氨基甲烷（Tris）：美國Sigma公司；無水碳酸鈉、無水乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、鄰苯三酚以上試劑均為分析純。

NCGF無水碳恒溫干燥箱：南京鑫長江制藥設備有限公司；WN500萬用粉碎機：廣州市旭朗機械設備有限公司；FA1004電子分析天平：沈陽龍騰電子有限公司；KQ-500DE數控超聲波清洗器：上海天實機電設備有限公司；TG16-W微量高速臺式離心機：張家港新華化工機械有限公司；WFZUV-2800AH紫外可見分光光度計：上海奧析科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 沒食子酸標準曲線

準確稱取沒食子酸標準品0.1 g，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，得到濃度為1 mg/mL的沒食子酸母液。準確吸取 0、1、2、3、4、5 mL 標準液于 100 mL 容量瓶中，加入蒸餾水定容，得到 0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的沒食子酸標準液，分別加入不同濃度的沒食子酸標準液1 mL于4 mL的離心管中，加入1 mL 0.25 mol/L的福林酚試劑，混合均勻靜置3 min，加入2 mL15%Na2CO3混合，靜置30 min，3 500 r/min離心3 min，760 nm處測吸光值。每組試驗平行測定3次，取平均值。根據沒食子酸含量及對應的吸光度繪制出沒食子酸標準曲線，得到的線性回歸方程為：y=28.443x+0.0677 9，r2=0.999 6。

1.2.2 洋蔥多酚的提取

把6 kg紫皮洋蔥用自來水沖洗干凈，去皮，切塊，裝盤后放入電熱鼓風恒溫干燥箱50℃恒溫干燥60 h。使用WN500型萬用粉碎機粉碎，過60目篩備用。

洋蔥中多酚含量的提取方法采用Folin-Ciocalteu試劑法[4]。1mL經超聲處理后的樣品液與1mL0.25 mol/L Folin試劑混合均勻，放置3 min，加入15%的Na2CO3溶液2 mL，再次混合、放置30 min，試樣經3500 r/min的高速離心機離心3 min，在760 nm處測吸光度。洋蔥多酚得率照下式計算：

式中：W為多酚得率，mg/g；C為多酚質量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數；m為洋蔥粉末質量，g。

1.2.3 多酚提取試驗設計

1.2.3.1 單因素試驗設計

為系統地考察超聲處理對洋蔥多酚得率的水平高低，分別選擇超聲功率（200、250、300、350、400 W）、超聲處理時間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）、乙醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%）和固液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）進行單因素試驗。

1.2.3.2 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上進行了響應面分析，選取超聲功率、超聲處理時間、乙醇濃度和固液比為4因子，每個因素選擇包括最佳水平在內的3水平，進行Box-Behnken中心組合試驗。通過響應面分析結果找到最優的超聲處理參數。因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken設計試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.4 體外抗氧化活性試驗

1.2.4.1 DPPH自由基清除活性的測定

取2 mL的樣品溶液和2 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L）放入試管中，充分攪拌后在陰涼避光處放置30 min，在517 nm處測定其吸光度A1。同樣方法測定2 mL無水乙醇和2 mL樣品溶液充分混勻后的吸光度A2和2 mL DPPH溶液加入2 mL蒸餾水的吸光度A0，同時用VC標準品作為對照[5]。

DPPH 自由基清除率/%=[1－（A1－A2）/A0]×100

1.2.4.2 羥自由基清除活性測定

取不同濃度的粗多酚樣品溶液1 mL分別加入到試管中，分別依次加入1 mL 8 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 8 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，1 mL 8 mmol/L H2O2[6]。充分混勻后靜置1 h，在510 nm處測定吸光值A2。同樣方法，用蒸餾水替代樣品測得吸光度A0；用蒸餾水替代H2O2測得吸光度A1。同時用VC標準品作為對照。

羥自由基清除率/%=[1－（A2－A1）/A0]×100

1.2.4.3 超氧陰離子自由基清除活性測定

取pH值為8.2質量濃度為50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液4.5 mL，放入25℃恒溫水浴中保持30 min，分別加入0.4 mL質量濃度為25 mmol/L的鄰苯三酚溶液和1 mL樣品溶液，攪拌均勻后在25℃恒溫水浴中放置4 min，加入1 mL質量濃度為8 mmol/L的鹽酸溶液搖勻。在波長320 nm處測定吸光度記為A1，同法以1 mL蒸餾水代替樣品測得吸光度記為A0[7]。同時用VC標準品作為對照。

超氧陰離子自由基清除率/%=（1－A1/A0）×100

1.3 數據分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件響應面試驗設計及分析，其余運用Microsoft excel軟件進行數據處理[8]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲功率對洋蔥多酚得率的影響

超聲功率對洋蔥多酚得率的影響見圖1。

圖1 超聲功率對洋蔥多酚得率的影響Fig.1 The impact of ultrasonic power on onion polyphenols extract single factor test results

從圖1中可以發現超聲處理對洋蔥多酚得率影響比較顯著，在超聲功率為350 W處，洋蔥多酚物質提取率最大，為10.33 mg/g。當超聲功率大于350 W后，多酚得率開始下降。研究表明，超聲波的空化作用和機械作用[9]可以起到破壞植物的細胞結構、加快分子的運動速率的作用，并且超聲功率越增強，植物細胞結構破壞得越嚴重，可以促使細胞內多酚物質的析出，最終導致多酚得率的降低。因此根據試驗數據進行分析的結果，超聲功率以350 W最為合適。

2.1.2 超聲處理時間對洋蔥多酚得率的影響

超聲處理時間對洋蔥多酚得率的影響見圖2。

圖2 超聲處理時間對洋蔥多酚得率的影響Fig.2 The impact of ultrasonic processing time on onion polyphenols extract single factor test results

從圖2中可以看出，在超聲處理時間為0.5 h～1 h內，洋蔥多酚提取率增幅很大，并且在處理時間為1 h處，洋蔥多酚得率最大，為10.154 mg/g。但是隨著提取時間的增加，洋蔥多酚得率卻逐漸減小，差異顯著。這一現象表明在一定的超聲處理時間段內，時間越長越有利于多酚物質的溶出；但是這個時間段之后，洋蔥多酚得率開始減小。查閱文獻發現超聲波熱效應會導致洋蔥中部分不太穩定的多酚分解轉化為其他物質，故在測量時會使得吸光度減小，最終導致計算得到的洋蔥多酚得率數值變小。不過也可能是因為長時間的超聲處理導致某些親醇類的物質溶出，這也會降低洋蔥多酚的提取率。同時超聲處理時間過長，浸出的洋蔥多酚物質可能在溶液內被氧化[10]，這也會對提取率造成一定的影響。最后，在實際操作中考慮到超聲處理時間的延長，會導致能耗和成本的增加，因此選擇超聲處理時間為1 h較為合適。

2.1.3 乙醇濃度對洋蔥中多酚得率的影響

乙醇濃度對洋蔥中多酚得率的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對洋蔥多酚得率的影響Fig.3 Ethanol volume fraction of onion polyphenols extraction effect of singe factor test results

從圖3中可以發現，當乙醇濃度在20%～80%范圍內，洋蔥中的多酚得率隨著乙醇濃度的變大而增加，差異顯著，在乙醇濃度為80%時，洋蔥中的多酚得率達到最大值為10.178 mg/g。但是將乙醇濃度擴大至100%時，洋蔥多酚得率卻反而下降至7.76 mg/g。眾所周知，多酚類物質經常與一些大分子物質通過化學鍵例如氫鍵形成復合物，當乙醇濃度較低、水分含量較高時，對氫鍵的破壞作用較小，這會造成多酚類物質不易溶出，最終使得通過超聲波輔助提取得到洋蔥中的多酚提取率不太樂觀。但是當乙醇濃度繼續增加，一些脂類、色素等雜質就會溶解[11]，這些成分會與多酚物質競爭，同乙醇水分子結合，最終導致多酚活性物質的溶解度降低，對多酚的提取率會造成一定的影響。因此選擇乙醇濃度為80%較為合適。

2.1.4 固液比對洋蔥多酚得率的影響

固液比對洋蔥多酚得率的影響見圖4。

圖4 固液比對洋蔥多酚得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of onion polyphenol

從圖 4中可以發現，固液比在 1 ∶10（g/mL）～1 ∶20（g/mL）范圍內，洋蔥多酚得率隨著液體體積的變大而減小，差異明顯。當固液比大于1∶20（g/mL），洋蔥多酚的得率隨著液體體積的增大而增大，并且當固液比為1 ∶40（g/mL）時，洋蔥多酚得率最大為11.737 mg/g。之后繼續增大到固液比1∶50（g/mL），洋蔥的多酚得率不升反降。因而選擇固液比為1∶40（g/mL）較為合適。

2.2 響應面結果與分析

2.2.1 回歸方程的建立與分析

結合單因素試驗的結果，以超聲功率、超聲時間、乙醇濃度和固液比為自變量，以洋蔥多酚物質的得率為響應值，進行四因素三水平響應面分析。試驗多次，使用Design Expert8.0.6將數據分析，其響應面試驗設計及結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 Box-Benhnken試驗設計及響應結果Table 2 Box-Benhnken design and response results values

續表2 Box-Benhnken試驗設計及響應結果Continue table 2 Box-Benhnken design and response results values

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

由表3可以看出，該回歸模型P＜0.000 1，方程模型極顯著。失擬項P=0.516 9＞0.05不顯著；該模型的確定系數R2=0.946 5，校正確定系數R2Adj=0.892 9，變異系數CV=5.14%，以上參數說明該模型擬合性好，試驗誤差小。根據回歸系數，得到洋蔥多酚得率的二次多元回歸方程為：

Y=12.26-0.52A-0.69B＋0.94C-0.36D＋1.71AB-0.15AC-0.05AD＋0.85BC＋0.63BD-0.92CD-1.21A2-1.63B2-0.98C2-1.14D2

由表3中方差結果可知，超聲提取洋蔥多酚的工藝參數中，對多酚得率影響的大小順序為：C固液比＞B超聲時間＞A超聲功率＞D乙醇濃度。其中C固液比、B超聲時間和A超聲功率達到極顯著水平，D乙醇濃度達到顯著水平。考察各因素間交互作用，AB、BC、BD、CD存在交互作用，其中AB、BC和CD達到極顯著水平，BD乙醇濃度達到顯著水平。

2.2.2 兩因素交互作用響應面分析

根根據回歸方程繪制響應面圖，通過觀察響應面的變化情況和稀疏程度可直觀地反映各因素相互作用對多洋蔥多酚得率的影響，結果如圖5所示。

圖5 兩因素交互作用對多酚得率的響應面圖Fig.5 Response surface diagram of interaction of two factors on polyphenol yield

當響應面的坡度越陡峭、等高線越密集而呈現扁圓形或馬鞍形時，則表示兩因子交互作用越顯著。通過對比，圖 5（a）、（d）、（e）、（f）這 3 個圖的曲面較陡峭、等高線較密集，圖 5（b）和（c）次之。表明超聲功率（A）和超聲時間（B）、超聲時間（B）和固液比（C）、超聲時間（B）和乙醇濃度（D）、固液比（C）和乙醇濃度（D）的交互作用顯著，與表3分析結果一致。

2.2.3 最佳條件的確定和模型的驗證

運用Design-Expert8.0.6軟件對洋蔥多酚提取率的二次多項模型實行了優化，選出超聲提取洋蔥多酚的最佳工藝參數：超聲功率321.48 W、超聲時間0.77 h、固液比1∶45.57（g/mL）、乙醇濃度75%，預測洋蔥多酚得率為12.9161 mg/g。考慮實際情況和可操作性，將洋蔥多酚的最優的工藝參數設定為：超聲功率320 W、超聲時間0.8 h、固液比1∶45（g/mL）、乙醇濃度75%，在此條件下得到的得率為12.77 mg/g，與預測值接近，說明了該模型可靠。

2.3 抗氧化分析

2.3.1 DPPH自由基清除作用

洋蔥多酚和VC對DPPH自由基清除率的影響見圖6。

圖6 洋蔥多酚和VC對DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of onion polyphenol and VCon DPPH radical scavenging rate

當洋蔥多酚的濃度在0.05 mg/mL～0.3 mg/mL之間時，隨著洋蔥中多酚濃度的不斷增加，其對DPPH自由基的清除率呈上升趨勢。繼續提高多酚濃度時，其對DPPH自由基的清除率不升反降。當洋蔥多酚的濃度為0.3 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達到86.2%。

2.3.2 洋蔥多酚對羥自由基清除活性分析

洋蔥多酚和VC對對羥自由基清除率的影響見圖7。

從圖7中可以看出，當洋蔥中多酚的濃度在0.05 mg/mL～0.3 mg/mL之間時，隨著洋蔥中多酚濃度的增加，對羥自由基的清除率也不斷提高，當洋蔥多酚的濃度為0.3 mg/mL時，對羥自由基的清除率達到86.4%。

圖7 洋蔥多酚和VC對羥自由基清除率的影響Fig.7 Effect of onion polyphenol and VCon hydroxyl radical scavenging rate

2.3.3 洋蔥多酚對超氧陰離子清除活性分析

洋蔥多酚和VC對超氧陰離子清除率的影響見圖8。

圖8 洋蔥多酚和VC對超氧陰離子清除率的影響Fig.8 Effect of onion polyphenol and VCon superoxide anion scavenging rate

從圖8中可以看出，當洋蔥中多酚濃度在0.05 mg/mL～0.3 mg/mL之間時，隨著多酚濃度的增加，對超氧陰因子的清除能力也逐漸增強，當洋蔥中多酚濃度為0.3 mg/mL時，清除率最高，達到80.6%。

3 結論

本文以紫皮洋蔥為原料，對超聲輔助提取洋蔥多酚的工藝進行了研究。采用響應面分析法，優化了超聲提取洋蔥多酚的工藝參數。優化得到的洋蔥多酚提取工藝參數為：超聲功率320 W、超聲時間0.8 h、固液比1∶45（g/mL）、乙醇濃度75%。此條件下，洋蔥多酚的得率為12.77 mg/g。體外抗氧化活性研究結果表明，在0.05 mg/mL～0.3 mg/mL的濃度范圍內，洋蔥多酚對DPPH·、羥基自由基、超氧陰離子自由基具有較強的清除性，表明洋蔥多酚具有良好的體外抗氧化活性，但洋蔥多酚的抗氧化能力比VC弱。