羊肚菌菌絲體液體發酵及其應用的研究進展

趙瑞華，賀曉龍，田茜

（1.延安大學生命科學學院，陜西延安716000；2.陜西省紅棗重點實驗室，陜西延安716000；3.延安大學經濟與管理學院，陜西延安716000）

羊肚菌（Morchella spp.）屬于子囊菌亞門（Ascomycotina），盤菌綱（Discomycetes），盤菌目（Pezizales），羊肚菌科（Morchellacea），羊肚菌屬（Morchella），民間又名羊肚菜、草笠竹、網兜蘑等，其菌蓋表層呈棱脊型網狀體，外觀像羊肚[1-2]。羊肚菌富含各類營養物質，且肉質脆嫩，風味獨特，而且含有多種抗菌、抗病毒的活性成分和能夠抑制腫瘤的多糖，具有調節機體免疫功能、抗疲勞等諸多作用，食藥用價值極高，開發應用前景廣闊[3-4]。

由于野生羊肚菌天然資源有限，環境條件要求苛刻，人工雖有大規模栽培但產量不穩定，產品品質參差不齊，所以急需尋求一種周期短、產量高的生產途徑[5]。而利用現代液體發酵生物工程技術，不僅大幅度提高菌絲體的積累量，同時產品的標準化程度高，可作為替代途徑。研究證明發酵培養的羊肚菌菌絲體和野生及人工栽培的子實體在營養成分和活性物質方面基本相同，且液體發酵成本低、工藝設備簡單，還能夠突破羊肚菌生長的環境限制因素，可以在較短的時間內獲得大量的菌絲體及其發酵產物。本文綜述了國內外關于羊肚菌的營養成分、揮發性成分及活性成分、液體發酵培養工藝和發酵液開發應用方面的研究進展，以期為羊肚菌液體發酵的深入研究和應用提供參考。

1 羊肚菌發酵物主要營養和活性成分

有關研究表明，羊肚菌發酵物（菌體和發酵液）和子實體一樣不僅富含蛋白質、脂肪酸、維生素、礦物質等營養成分，還富含多糖、多酚、甾醇、酶類等活性成分，賦予羊肚菌發酵物極高的利用價值[6]。

1.1 主要營養成分

羊肚菌發酵液菌絲體中蛋白質含量大于20%，其中人體必需氨基酸含量略低于子實體，氨基酸營養價值均衡。羊肚菌發酵液菌絲體中維生素和脂肪酸含量豐富，種類都較多，尤其不飽和脂肪酸的大量存在賦予其降血脂、抗衰老、消除自由基的功效。在發酵液和菌體中檢測到豐富的碳水化合物和16種礦物元素，但未檢測出對人體有害的重金屬Hg、Pb、Cd和As，從安全性來說優于子實體。綜合近幾年研究，羊肚菌發酵物營養成分種類見表1。

表1 羊肚菌發酵物營養成分種類Table 1 Categories of nutrients in fermentation of Morchella esculenta

羊肚菌發酵物中含有大量的多糖，一般認為多糖是起藥理作用的主要活性物質，也是羊肚菌可以提高機體免疫力、抗病毒、抗癌及抗疲勞等作用的基本物質成分；此外也發現游離酚、結合酚，其提取物存在細胞抗氧化作用，可以有效的抑制HepG2細胞、Caco-2細胞的增殖；有研究證明從羊肚菌發酵菌絲體中提取出的三萜類化合物具有一定的抗氧化活性和抑制腫瘤細胞的能力。綜合近幾年研究，羊肚菌發酵物活性成分種類見表2。

表2 羊肚菌發酵物活性成分種類Table 2 Categories of active components in fermentation of Morchella esculenta

1.2 主要揮發性成分

羊肚菌菌絲體和發酵液還含有醇類、酮類、醛類、烴類、烯類、酸類和呋喃類等復雜的揮發性風味成分，這些揮發性化合物之間相互作用、相互平衡賦予了羊肚菌發酵物獨特的風味。發酵液中主要的揮發性物質是以1-辛烯-3-醇和苯乙醇為主的醇類化合物；菌絲體中揮發性醇類化合物主要是苯乙醇和1-辛烯-3-醇這樣的八碳化合物，其中苯乙醇對羊肚菌菌體風味起主要作用，是最簡單的芳香醇之一[21]。綜合近幾年研究，羊肚菌發酵液和菌絲體揮發性成分見表3。

2 羊肚菌的液體深層發酵培養

在羊肚菌生長發育過程中將必需的營養物質混合在水溶液中，通過人為控制其培養條件，可以培養出大量菌絲體，且在液體深層發酵培養過程中，羊肚菌可產生與從天然采集的羊肚菌子實體化學組成相近的各種成分。且液體發酵培養的培養基原料來源豐富，培養條件易于控制，周期短，產量穩定。據有關資料報道，1958年美國Szuecs首次利用液體發酵培養出羊肚菌菌絲體，并設計了利用發酵桶進行大規模生產的試驗[22]。我國較早的報道是1986年Ghosh和王曉明的一篇譯文，介紹了利用單碳源、食品和工業廢料作基質，對羊肚菌進行深層培養的結果[23]。羊肚菌的液體發酵培養己經成為羊肚菌栽培的一種新模式，也是近年來對羊肚菌研究的熱點。通過對羊肚菌發酵液菌絲體營養成分的研究，為羊肚菌活性成分的深層開發以及實現大規模商品化生產打下了堅實的基礎。法國、美國等國家開始進行工業化液體發酵，大規模生產羊肚菌菌絲體，應用于食品、醫藥、化工等各領域[24]。羊肚菌發酵也有了專用的發酵設備。

表3 羊肚菌發酵液和菌絲體揮發性成分Table 3 Volatile components in fermentation and mycelium of Morchella esculenta

我國早期的探索側重于發酵培養基配方的篩選。高愛華等[25]曾對羊肚菌液體培養進行初步探索，篩選出液體培養基配方，但是培養時間過長，需要9 d才能放罐，并且需要添加昂貴的麥芽。張松[26]探討高羊肚菌菌絲球在不同液體培養基中的生長情況，發現在黃豆芽玉米粉培養基中菌絲球最多，大小均勻，菌絲生長量最大，在麥鼓蛋白陳培養基上菌絲中的糖含量最高。王小雄等[27]對采自甘南的尖頂羊肚菌（Morchella conica）經深層發酵得到發酵液和菌絲體，并測定其中的營養成分。劉士旺等[28]和趙啟良等[29]則通過正交試驗篩選出羊肚菌搖瓶培養的培養基，并探索羊肚菌液體發酵的合適條件。

近年來，Ma等[30]研究在攪拌槽生物反應器中進行液體發酵時不同攪拌方式對羊肚菌菌絲生長的影響，發現間歇攪拌可提高菌絲體的生長速率、生物量濃度和最大生產力。王瑩等[31]研究羊肚菌液體深層發酵動力學，基于Matlab軟件平臺，應用遺傳算法就真菌生長較常用的Logistic與Monod方程在描述羊肚菌生長動力學時的優劣進行對比，并估計了羊肚菌的生長、胞外多糖產生和基質消耗模型的參數。羊肚菌發酵動力學模型的建立奠定了發酵優化及放大的基礎。這一時期對培養基配方的篩選和條件的優化日趨成熟，王云龍篩選的羊肚菌液體發酵最佳培養基為：麥芽汁9.5%、玉米粉40 mg/L、黃豆粉20 mg/L、酵母粉3 mg/L。最優培養條件為：溫度（24±1）℃、轉速 140 r/min、pH 6.0以及接種量10%[32]。季向陽等篩選的液體發酵最佳轉速、pH值及接種量同王云龍，溫度為25℃恒溫培養120 h[33]。滕國生等[34]利用Plackett-Burman設計對影響羊肚菌發酵罐培養條件的諸多因素進行考察，采用Box-Behnken設計對篩選得到的關鍵因素深入優化，對試驗結果分別進行響應面回歸分析和神經網絡結合遺傳算法分析，獲得羊肚菌5 L發酵罐液體培養最佳條件：初始 pH 6.83，轉速 200 r/min，發酵時間 4.5 d，發酵溫度26℃，接種量3%，種齡3 d，通氣量200 L/h，裝液量3.22L/5L。而后李紅等[35]以梯棱羊肚菌（Morchella importuna）菌株FY2為試材，利用正交試驗對液體配方和發酵條件進行了優化。結果表明菌絲培養最適條件為溫度25℃，初始pH 7，接種量5%；分別選擇葡萄糖和黃豆粉做為羊肚菌菌絲生長的最佳碳源和氮源。

目前通過對液體發酵的培養條件和培養基成分進行優化來獲得某種目的產物己經成為液體深層培養的一種發展趨勢，它有利于對羊肚菌的各種化學成分進行深入研究，并滿足消費者的需求。

3 羊肚菌液體發酵的應用

通過液體發酵，羊肚菌菌絲體獲得成品的時間相對于羊肚菌子實體而言大大縮短，并在獲得有效化學成分等方面存在優勢，現在越來越多的研究者熱衷于開發以羊肚菌液體發酵菌絲體為原料的產品。

3.1 液體制種

在羊肚菌人工栽培中，固體制種方式耗時長、純度低、菌齡不一致、成本高，無法滿足羊肚菌規模化高效栽培的需求。而食用菌液體菌種具有生產成本低、制作周期短、菌種品質佳等優點。早在1996年，張松曾進行過羊肚菌液體菌種培養配方的初步研究，獲得菌絲球多，大小較均勻，質量較高的液體菌種[36]。許瀛引等[37]則通過控制羊肚菌菌絲球的密度和直徑來提高菌絲體生物量，先模擬試驗優化羊肚菌液體菌種繁育條件，再通過發酵罐進一步驗證，制得優質的羊肚菌液體菌種，接種栽培后發現菌絲體生長健壯，菌絲滿袋天數較原固體菌種所需時間縮短了2/3，和現階段其他液體菌種制備方法相比縮短30%。這些研究奠定了羊肚菌液體菌種工廠化生產的技術基礎，也為液體菌種在栽培中的應用及工業化生產羊肚菌菌絲體相關產品的開發提供理論參考。

3.2 食品開發

隨著現代發酵技術的發展，研究發現羊肚菌液體發酵物及產生的菌絲體都能保留其有效成分和香味。美國、法國等國在60年代已大規模生產菌絲體，制造調味品[38]，近年我國也有研究者通過復合酶法對呈鮮氨基酸進行提取，有助于利用發酵技術制備羊肚菌鮮味物質，實現其高質化利用[39]。關于羊肚菌風味食品的研究，最早國內宋淑敏曾使用羊肚菌在大豆汁、麥芽汁中發酵后制成保健飲料[40]。王秀云[41]將液體培養的羊肚菌菌種均勻噴灑在腐乳乳胚上，經過發酵和腌制，得到了香味獨特、營養豐富的羊肚菌腐乳。路等學等[42]將羊肚菌發酵液添加入其它食物中，制成具有特殊風味的保健杏脯和保健話梅等。張青等[43]利用羊肚菌發酵菌絲體探討了羊肚菌保健酒的釀造工藝，獲得的羊肚菌保健酒色澤、風味俱佳。冮潔等[44]則利用以豆渣為原料發酵產生的羊肚菌菌絲體，研制得到了醋酸含量達5.04 g/100 mL的羊肚菌菌絲體保健發酵醋。張珍將羊肚菌發酵液真空抽濾后加到乳飲料中，進行二次調酸開發了營養豐富、風味獨特的羊肚菌復合保健乳飲料[45]。付天宇以粗柄羊肚菌（Morchella crassipe）926號液態發酵得到的菌絲體為主要原料，分別制備了羊肚菌多糖口服液和羊肚菌調味料等新型功能性食品，研究了搖瓶發酵條件對羊肚菌調味料風味的影響[46]。趙航等[47]利用羊肚菌液體發酵菌絲體代替子實體，制備出口感佳、營養豐富、可調味增香的羊肚菌調味醬。利用羊肚菌液態深層發酵開發研究功能性食品具有越來越廣闊的發展前景。

3.3 藥物研發

羊肚菌發酵液和菌絲體均含有多種藥用活性成分。宋淑敏等[48]曾將羊肚菌在麥芽汁、大豆汁中發酵提取液濃縮后制備成供糖尿病和膽固酵增高癥患者服用的藥物。楊英杰通過液體發酵以現代口含片生產技術研制出口感細膩、芳味獨特的羊肚菌和圓酵母雙菌口含片[49]。明建等[50]研究羊肚菌多糖PMEP-1對大鼠腸道短鏈脂肪酸的影響及降血脂作用，結果發現PMEP-1對高脂血癥的發生、動脈粥樣硬化及冠心病都有一定的預防作用，可用于新型降血脂類藥物的研制。羅霞等[51]和高明燕等[52]的研究發現尖頂羊肚菌菌絲體水提液可明顯降低胃黏膜損傷指數，增加胃黏液與胃蛋白酶的分泌，促進胃潰瘍面積的愈合，對酒精引起的大鼠急性胃黏膜損傷起到很好的保護作用。賈建會等[53]的研究發現羊肚菌發酵液既對小鼠脾淋巴細胞增殖有直接刺激作用，還可協同刀豆蛋白A促進小鼠T淋巴細胞轉化。近年研究還發現，羊肚菌發酵液菌絲體對各種營養素特別是鍺、硒、VE等具有較強的富集及轉化作用[54]。

國外研究人員曾從羊肚菌發酵液中分離得到了一種比阿司匹林效價要高出2～3倍的血小板集落抑制因子和一種可抑制酪氨酶的黑色素形成抑制劑[55-56]；Duncan等[57]分離到一種能增強巨噬細胞活化的半乳甘露聚糖；Nitha等則通過慶大霉素和順鉑聯用制備小鼠腎毒性模型，發現羊肚菌菌絲體提取液，可顯著降低模型小鼠血清肌酐和尿素氮含量，提高小鼠谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase from micrococcus lysodeikticus，CAT）和超氧化物岐化酶（super oxide dismutase，SOD）的活性，對腎臟起到保護作用[58]。

但上述研究也僅初步發現羊肚菌發酵液的藥用價值，并不清楚是哪種生物活性物質在發揮作用，為了更好地為人類所用，還需要進一步研究。

3.4 發酵提取羊肚菌多糖

采用深層液體發酵法培養羊肚菌菌絲體具有明顯降低成本、提高生產效率等優點。早期國內賈建會等[59]曾探索過以羊肚菌液體深層發酵獲得的菌絲體和發酵液為原料提取、分離及純化羊肚菌多糖。后來蘭瑛[60]和李美華等[61]分別以尖頂羊肚菌和粗柄羊肚菌菌絲體為試驗材料進行胞外多糖的提取并對提取工藝進行優化。孫玉軍等[62]研究中性蛋白酶提取富硒羊肚菌菌絲體多糖提高產量的條件。He等[63]通過單因素試驗和中心組合設計，得到制備羊肚菌多糖的液體發酵最佳培養基：麥芽糖44.79 g/L，胰蛋白酶原4.21 g/L。國外Taskin等[64]研究了雞毛蛋白水解物作為羊肚菌菌絲體生物量和胞外多糖液體發酵基質的可行性，研究首次表明，雞毛蛋白水解物可以有效地作為一種新型的羊肚菌液體發酵生產胞外多糖的基質。

4 展望

現在對羊肚菌的液體發酵培養多集中于液體發酵培養基和培養條件的優化、菌絲體有效化學成分的研究、液體發酵菌絲體相關產品的開發等。通過改變發酵培養基配方和培養條件來獲得某種符合市場需求的目的性產物己成為一種有效途徑。羊肚菌菌絲體通過液體發酵培養來解決市場上野生羊肚菌資源不足和人工栽培周期長的問題，是羊肚菌的一大研究熱點。

未來研究應繼續對羊肚菌液體培養條件進行優化，通過最優的培養方式最大限度的獲得產品，篩選既可以滿足羊肚菌生長需求，且來源方便、價格便宜，大規模生產的培養基原料替代品。目前羊肚菌營養和活性成分在食品、化妝品、醫藥保健品等方面均有應用，但起作用的生物活性成分并不清楚，并且大部分研究集中于羊肚菌多糖的生產和利用，在羊肚菌中還有可能存在著對人類更加有益或價值更高的化學成分有待發掘，所以也應繼續深入研究羊肚菌活性成分及其功效，為羊肚菌的應用提供理論依據。羊肚菌液體培養相關產品的研發多集中于保健品的開發，應該還存在著很大的發展空間，如飼料等產品的研發，可使發酵液的剩余營養成分得到充分的利用，提高經濟效益，也可減輕培養殘基對環境的污染，具有環保意義。

相信隨著現代生物學技術的不斷發展，微生物學、發酵工程、食藥用真菌學等多領域學科的交叉滲透，羊肚菌發酵技術將會越來越完善，也會推動整個羊肚菌產業的快速發展。