食源性致病菌核酸檢測技術研究進展

鐘宜科，鄒大陽，趙彤，花曉丹，馮洋，劉威，*，王永霞，*

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲056000；2.中國人民解放軍疾病預防控制中心，北京100000）

在過去的30年食源性疾病的發病率明顯增加，食源性疾病已經成為全球主要的公共問題之一[1]。世界衛生組織（World Health Organization，WHO）[2]統計顯示由病原微生物引起的食源性疾病比例達50%以上。食源性疾病是因為食用致病菌或其毒素污染的食物或水引起。食源性致病菌包括細菌、病毒、真菌和寄生蟲[3]。據報道[4]已被確認的食源性致病菌多達31種。引起食源性疾病常見致病菌為大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌、腸道沙門氏菌、空腸彎曲菌、單核細胞增生李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌、產氣莢膜梭狀芽胞桿菌和產志賀毒素大腸桿菌等[1，4]。各種街邊食品[5]、水果，蔬菜等即食食品、生的或未煮熟的食物海鮮、肉類[6]，這些都會引起食源性疾病的發生。為確保食品供應安全，減少食源性疾病的發生，對食品中是否存在食源性致病菌進行分析至關重要。

食源性致病菌的檢測方法包括傳統培養法和免疫學方法。其中，傳統培養法[7]是金標準，但操作繁瑣，對操作人員技術水平要求比較高且檢測周期長，需要2 d～20 d不等，而且屬內種間生化差別不明顯；免疫學[8]方法是基于抗原抗體特異性結合的反應原理，操作簡單、方便快速是其突出特點，但其最大的缺點是靈敏性不足，經常造成假陰性結果，容易漏篩，不能完全滿足致病菌的檢測需求。

多年來，為了克服傳統檢測方法的局限性，一種簡便、高特異性、高靈敏的核酸檢測方法應運而生，其通過檢測目標病原體的特定DNA或RNA序列，將目標核酸序列雜交到與目標序列互補的合成寡核苷酸（探針或引物）來完成病原體的檢測。另外，一些產毒素的病原體，如霍亂弧菌、大腸桿菌O157、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌等也可通過核酸檢測技術檢測到其中的毒力因子[3]。

1 核酸檢測技術

1.1 常規PCR

常規聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術是食源性致病菌檢測常用的分子生物學方法。常規PCR可以通過檢測特定目標DNA序列來檢測食品中存在的單一細菌病原體。其原理為：首先經過熱變性雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA；然后退火，引物與模板的互補區相結合；最后經過延伸，合成DNA，獲得目的片段。最后將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳進行擴增產物的檢測。Chiang等[9]和Zhou等[10]建立了食品中大腸桿菌O157、單核細胞增生李斯特菌、副溶血弧菌、沙門氏菌和志賀氏菌常規PCR檢測方法。這種檢測方特異性強、靈敏度高、儀器便宜，但易受到抑制劑的影響；并且要通過瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行結果判讀，耗時長，對檢測人員技術要求高。

1.2 多重PCR

多重PCR（multiplex-PCR，mPCR）是由常規PCR衍生出的一種擴增技術。在一個反應體系中加入兩對以上的引物，可同時擴增出多個目的片段，較常規PCR更加快速方便。引物設計是多重PCR最關鍵的步驟，只有反應中引物具有相似的退火溫度時，才能成功的進行多重PCR分析[3]。此外，反應體系中的引物濃度、緩沖液、mg2＋和dNTP濃度、DNA模板濃度、反應溫度和Taq酶都會影響檢測結果[11]。Park等[12]建立了同時檢測食品中大腸桿菌O157：H7（Stx2A）、沙門氏菌（Its）、金黃色葡萄球菌（Cap8A-B）和單核細胞增生李斯特菌（Hly）的多重PCR方法；Ryu等[13]建立了一種同時檢測和鑒別6種李斯特菌的多重PCR方法，且具有較高的特異性；Zhou等[14]建立一種新的多重PCR方法，即GeXP-PCR，可檢測食品中大腸桿菌O157、單核細胞增生李斯特菌等6種病原菌。其中，GeXP[15]（genome lab gene expression profiler）多重基因表達遺傳分析系統與毛細管電泳分析技術相結合，利用帶有熒光標記的通用引物和特異性嵌合引物的聯合擴增，使目的基因得到高效表達，該技術具有特異性強、靈敏度高、高通量及檢測速度快等優點。

1.3 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）與常規PCR相比，其不需要對樣品進行擴增后處理，而是通過熒光染料或熒光標記特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控[16]。由于其快速、特異性強和靈敏度高等特點，越來越多的應用到食源性致病菌的檢測中。qPCR還可以通過研究合適的靶基因的表達來量化食物中的一種特定微生物。目前應用較多的qPCR方法有染料法（synergy brands green，SYBR Green）、探針（TaqMan probes）和分子信標（molecular beacons）。

SYBR Green是一種只與雙鏈DNA結合的染料，當反應液鐘只有單鏈DNA時，其不發光，只有摻入DNA雙鏈中才可發光。其工作原理見圖1。

在擴增反應過程中，引物退火并形成PCR產物，擴增完成后，SYBR Green染料與雙鏈DNA結合，定量PCR系統檢測到熒光值升高。Tyagi等[18]建立了一種用于檢測熱帶貝類中致病性tdh陽性副溶血性弧菌的高靈敏性SYBR Green qPCR檢測方法；Jun Kawase等[19]建立了一種可同時檢測16種食源性致病菌的SYBR Green qPCR方法。TaqMan探針法的工作原理見圖2。

圖1 SYBR Green熒光定量PCR原理[17]Fig.1 Principle of SYBR green quantitative PCR

圖2 TaqMan探針熒光定量PCR原理[17]Fig.2 Principle of TaqMan probe fluorescence quantitative PCR

探針 3′端淬滅基（quencher，Q）能夠吸收 5′端報告基團（reporter，R）發出的熒光，因此，沒有擴增反應時，無法檢測到熒光信號，當溶液中有PCR產物（模板）時，探針與模板退火，即產生了適合于核酸外切酶活性的底物，從而激活Taq酶的5′外切酶活性，將探針5′端連接的報告基團切割下來，破壞了兩個熒光分子間的熒光共振能量轉移，從而發出熒光，檢測到擴增信號。Fusco等[20]通過TaqMan qPCR定性、定量分析了牛奶中的產腸毒素金黃色葡萄球菌。

分子信標（molecular beacon）[21]是一種熒光標記的寡核苷酸鏈。由3部分組成：（1）環狀區：由15～30個可與靶分子特異性結合的核苷酸組成；（2）莖干區：由5個～8個可發生可逆性解離的堿基對組成；（3）熒光基團和淬滅基團：分子信標的兩個末端分別標記熒光基團和淬滅基團。其工作原理見圖3。

沒有靶分子存在的時候，分子信標的熒光基團和淬滅基團靠得很近，熒光被淬滅，但與靶分子結合后，分子信標的空間構型發生了改變，使熒光恢復。Liming等[22]首次通過分子信標qPCR技術檢測了水果和蔬菜中的沙門氏菌。

圖3 分子信標熒光定量PCR原理[17]Fig.3 Principle of molecular beacon fluorescence quantitative PCR

上述3種方法中，SYBR Green法較TaqMan探針法和分子信標法更加便宜和簡單，并且其擴增結果可通過溶解曲線的Tm值進行直觀的判斷。但SYBR Green法檢測的是體系中的所有雙鏈DNA，因此，反應中產生的非特異性擴增或引物二聚體，容易造成假陽性，而TaqMan探針法和分子信標法是序列特異性探針，只能與靶序列結合，不會產生引物二聚體，較SYBR Green法更加的靈敏，但Klerks等[23]研究表明基于PCR的檢測方法的靈敏性主要受引物特異性，引物序列和退火溫度的影響。

1.4 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是 Notomi等[24]在 2000 年建立的一種核酸擴增技術。該方法需要4條～6條引物特異性的識別目標片段的6個～8個區域，具有簡單、特異、高效、迅速的優點。在DNA聚合酶的鏈置換作用下，可在短時間內擴增靶序列，同時產生白色的焦磷酸鎂，這一特性可通過濁度來判斷。Maruyama等[25]首次通過這種方法進行了食源性致病菌大腸桿菌O157：H7（stxa2）的檢測；Wang等[26]研究表明，由于LAMP引物需特異性的結合目標片段的6～8個區域，使得LAMP比PCR具有更高的靈敏性和特異性。目前，由LAMP衍生的檢測方法有反轉錄LAMP[27]、多重LAMP[28]、實時反轉錄LAMP[29]等。

1.5 聚合酶螺旋反應

聚合酶螺旋反應（polymerase spiral reaction，PSR）是由Liuwei等[30]建立的一種新型的恒溫擴增技術。該方法是利用具有熱穩定性、鏈置換功能和DNA聚合酶活性的酶（Bst DNA聚合酶）在等溫條下進行擴增的方法。該法從LAMP引物設計中得到啟示，并融合PCR法引物設計簡便的優點，僅在PCR引物的基礎上從目標序列上再取一段序列加到PCR引物的5′端，構成正反向復合引物，滿足了簡便快速、高靈敏度和特異性的要求。朱淵等[31]建立了銅綠假單胞菌PSR檢測方法；董德榮[32]通過PSR建立了一種具有高特異、高靈敏性，用于現場檢測食品中霍亂弧菌的方法。

1.6 重組酶聚合酶擴增技術

重組酶聚合酶擴增技術（recombinase polymerase amplification，RPA），是由Olaf Piepenburg等研發的一種等溫核酸擴增技術。它依賴于特定的酶和蛋白組合（重組酶、單鏈結合蛋白和DNA聚合酶），在常溫條件下反應5 min～20 min即可獲得結果。目前，由RPA衍生出的檢測方法有直接重組酶聚合酶擴增技術（Direct-RPA）[33]、重組酶聚合酶擴增側流層析技術（RPALFD）[34]、實時重組酶聚合酶擴增技術（Rea-ime RPA）[35]等。Ji等[36]建立了腸炎沙門氏菌實時熒光RPA快速檢測方法，用于檢測雞蛋和雞肉中的腸炎沙門氏菌。研究發現，該方法和實時熒光PCR相比，具有檢測時間更短，靈敏度更高的優點。郭燕華等[37]以Cytb基因為靶序列，建立了一種用于檢測生鮮肉中豬源成分的RPA技術，該方法能快速鑒別豬肉中的豬源成分，特異性好，靈敏度高。Heeseop等[38]建立了一種基于紙芯片的一步法RPA，于37℃反應20 min即可獲得結果。

快速檢測食品中的食源性致病菌，防止食源性疾病的爆發和食源性致病菌的傳播具有重要意義。目前，已經建立許多食源性致病菌快速檢測方法，見表1。

表1 核酸檢測技術在食源性致病菌檢測中的應用Table 1 Examples of the application of nucleic acid-based methods for the detection of various foodborne pathogens present in food samples

但是大多數的方法需要一些技術人員、昂貴的儀器，只能在實驗室進行，無法滿足現場快速檢測，限制了其使用范圍。基于核酸檢測的方法都有其各自優點和局限性見表2。

但是怎么將這些優點集于一體，是我們未來研究的重點。本文綜述了10年來基于部分核酸快速檢測方法及其在食源性細菌性致病菌檢測中的應用及其優點和局限性。

表2 快速檢測方法的優點和局限性Table 2 The summary of advantages and limitations of each rapid detection methods

2 結論

以傳統培養法為基礎的食源性致病菌檢測方法具有選擇性，但費時費力，在實際使用中，需要數天到一周的時間，因此急需建立快速的檢測方法，以此來克服傳統檢測方法的局限性。快速檢測食品中的食源性致病菌，防止食源性疾病的爆發和食源性致病菌的傳播具有重要意義。新興的等溫擴增技術如LAMP、RPA和PSR因其操作簡單、不需要熱循環以及不需要大型儀器等，未來其在食源性致病菌現場檢測具有廣泛的前景。

幾十年來，研究人員在食源性致病菌檢測方面進行了大量研究，但目前的技術仍需要改進。所有的快速檢測方法都需要一定的前處理，這是快速檢測中一個非常重要的環節，也是快速檢測發展中的一個瓶頸。食品基質、致病菌的數量（＜100 CFU/g）都會影響檢測結果的正確性。綜合各種方法的優點，創造新的檢測方法，以此加快食源性致病菌檢測技術進程。