臭鱖魚中氨基酸產生菌的分離鑒定及其加工特性評價

趙柄舒，王夢竹，陳丹丹，沈弘洋，代偉長，劉俊梅*

1(吉林農業大學 食品科學與工程學院，吉林 長春，130118) 2(吉林省食品生物制造科技創新中心，吉林 長春，130118)

臭鱖魚是我國傳統發酵食品之一，以自然發酵的制作方式賦予臭鱖魚獨特風味，深受人們喜愛。目前，臭鱖魚制作多以手工作坊加工為主，經食鹽腌制后置于自然環境發酵而成[1-2]。臭鱖魚現有制作工藝受不同區域、腌漬方式及自然環境的影響，不同批次產品存在品質差異大，風味組成穩定性差，安全性低等問題[3-4]，這主要是由于發酵過程中產生的微生物菌群不可控，導致魚肉蛋白的降解程度有差異，直接影響風味物質組成。魚肉經發酵過程中微生物酶作用降解為小分子肽、游離氨基酸等風味物質，這些物質是貢獻滋味的核心成分，其中游離氨基酸的含量和種類直接影響臭鱖魚的鮮味[5-6]。同時，臭鱖魚發酵過程中產生腐敗致病菌及生物胺等有害物質，是造成臭鱖魚制品安全品質低的主要原因[3, 7]。文獻報道，發酵食品風味組成較為復雜與其菌群結構相關[8-11]。為進一步探究臭鱖魚中菌株與風味間的相互作用，有學者采用傳統微生物培養方法分離菌株，如楊培周等[12]在發酵8 d的臭鱖魚中分離出以蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌為主的微生物；李燕[7]對臭鱖魚發酵過程中微生物進行分離，發現菌群豐富多樣且隨發酵時間的延長而遞減。臭鱖魚中的微生物菌株與發酵風味的形成息息相關，經菌株發酵后游離氨基酸的組成直接影響臭鱖魚的鮮味。同時，對分離菌株的特性進一步探討，羅靚芷等[13]篩選并鑒定得到臭鱖魚中4株優良乳酸菌，進行了耐鹽性、發酵性和生長特性研究。但針對產氨基酸風味菌株篩選及加工特性評價的研究較少。本研究分離篩選自然發酵臭鱖魚中氨基酸產生菌，對篩選菌株進行鑒定并評價其加工特性，為進一步提高臭鱖魚的安全品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分離菌株的樣品來源

臭鱖魚，徽府源食品有限公司，冰藏(-10～-20 ℃)運送至實驗室保藏待用。

1.1.2 主要試劑及培養基

Si 60 F254薄層層析硅膠板，上海默克化工技術有限公司；L-天冬氨酸、L-谷氨酸等17種標準品(純度>99%),北京鼎國生物技術有限責任公司；茚三酮、異丙醇、甲酸等化學試劑(AR級)，國藥集團化學試劑有限公司；MRS肉湯培養基(MRS)、營養肉湯培養基(NB)、LB肉湯培養基(LB)、無氮培養基(NCM)，青島高科園海博生物技術有限公司。

氨基酸對照液配制：準確稱取0.001 gL-天冬氨酸、L-谷氨酸等17種標準品溶于1 mL體積分數10%異丙醇溶液，即得質量濃度為1 g/L的氨基酸對照液。

氨基酸標準液配制：準確稱取亮氨酸23.4 mg，以體積分數10%異丙醇溶解定容至50 mL，為標準液，將標準液50倍稀釋即為工作液(游離氨基氮量為1 μg/mL)。

水合茚三酮配制：準確稱取0.6 g茚三酮，依次加入15 mL 正丙醇、30 mL 正丁醇、60 mL 乙二醇及9 mL pH 4.54的醋酸鹽緩沖液混勻，儲存在棕色瓶中，4 ℃保存。

質量濃度1 g/L抗壞血酸配制：準確稱取0.01 g抗壞血酸，加水溶解并定容至10 mL。

1.1.3 主要儀器與設備

TL-18M高速冷凍離心機，上海市離心機械研究所；Infinite M200 Pro NanoQuant酶標儀，瑞士帝肯(Tecan)公司；2720 PCR擴增儀，3730XL測序儀，美國應用生物系統(ABI)公司；Mini Pro 300V Power Supply電泳儀，美國major science公司；Sub System 70電泳槽，美國Labnet公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌分離

無菌操作下，將少量臭鱖魚魚肉剪碎，準確稱取25.0 g放置于225 mL無菌生理鹽水中搖勻。選取3個連續的稀釋梯度液，移取0.1 mL涂布于NB固體培養基中，置于37 ℃培養箱中培養48 h，挑取形狀不同的單菌落，經多次劃線純化，所得純菌株于NB斜面培養基進行劃線，37 ℃靜置培養48 h，置于4 ℃保藏[14]。

1.2.2 氨基酸產生菌株初篩

分離菌株傳代培養：采用無菌操作挑取斜面培養基上的菌落接種于NB液體培養基，37 ℃靜置培養24～48 h，然后各菌株按照2%接菌量接種于NB液體培養基，完成2代培養。

將菌株活化后的菌液以2%接種量接種于NCM液體培養基中，37 ℃靜置培養24 h，重復上述操作傳代培養后菌液于9 000 r/min離心10 min，取菌株上清液待測[15]。采用薄層層析法(thin-layer chromatograph，TLC)對菌株上清液中氨基酸組成進行定性分析。

1.2.3 氨基酸產生菌株復篩

將菌株活化后的菌液以接種量2%接種于NCM液體培養基中，37 ℃靜置培養24 h，傳代培養2次后菌液于9 000 r/min離心10 min，取菌株上清液待測[15]。采用茚三酮比色法對菌株上清液中游離氨基氮總量進行定量分析。

測定方法參照文獻[16]進行改良。取各菌株上清液1.0 mL分別加入一組具塞刻度試管中，加入無氨蒸餾水1.5 mL、3 mL水合茚三酮和0.1 mL抗壞血酸，密封試管口，于渦旋振蕩器混勻，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后加體積分數60%乙醇定容至20 mL，測定反應后溶液的OD570 nm值，代入標準曲線回歸方程，計算游離氨基氮總量(μg/mL)，測定均重復3次。

1.2.4 16S rRNA序列分析鑒定菌株

將復篩獲得的菌株進行活化培養，傳代2次后于12 000 r/min離心30 s，收集菌體。PCR擴增引物：正向引物27 F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物：1492 R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。引物的合成和PCR產物的測序委托上海桑尼生物科技有限公司完成。擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min 30 s；35個循環后，72 ℃延伸7 min。將所得基因序列于NCBI BLAST系統中進行比對，使用Clustal X和MEGA 7.0軟件采用Neighbor-Joining(NJ)法構建系統進化樹，提交序列信息至GenBank獲取基因登錄號。

1.2.5 菌株耐鹽性試驗

菌株耐鹽性試驗參照文獻[17]進行改良。將獲得菌株于37 ℃培養24 h，以1%的接種量分別接種至含4、6、8、10 g/100 mL NaCl的MRS液體培養基中，未添加NaCl的MRS液體培養基作空白對照，培養36 h后測定菌液OD600 nm值，測定均重復3次。

1.2.6 菌株氨基酸脫羧酶試驗

參照文獻[18-19]并進行改良。將獲得的菌株于37 ℃培養24 h，以1%接種量分別接種至含10 g/L精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸及酪氨酸的MRS液體培養基中(含0.6 g/L溴甲酚紫作為指示劑)，不添加氨基酸的液體培養基作為對照，37 ℃培養3 d后，與對照相比，觀察氨基酸脫羧酶培養基的顏色變化，判定菌株的脫羧酶活性。

1.2.7 菌株抑菌試驗

通過牛津杯法[20]測定菌株抑菌活性。將獲得的菌株接入MRS液體培養基中，于37 ℃培養24 h后在9 000 r/min離心10 min，獲得上清液，于4 ℃保存備用。選擇沙門氏菌(Salmonella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)作為指示菌株，依次接種至NB、MRS及LB液體培養基，于37 ℃活化培養24 h，各取100 μL菌液于相應固體培養基上涂布，插入無菌牛津杯，注入200 μL菌株上清液，等體積注入空白MRS液體培養基作對照，于37 ℃培養12 h后測量抑菌圈的直徑。試驗測定均重復3次。

1.2.8 氨基酸測定方法

1.2.8.1 氨基酸的定性測定

以質量濃度1 g/L的氨基酸標準液為對照，使用毛細管點樣，點樣間距1 cm，點樣量2 μL，點樣后用吹風機吹干，展開劑：V(異丙醇)∶V(甲酸)∶V(水)=40∶2∶10；顯色劑：5.0 g/L茚三酮。展開結束置于85 ℃干燥箱中顯色5 min。

1.2.8.2 氨基酸的定量測定

取1組具塞刻度試管，按表1依次加入試劑后密封試管口，于渦旋振蕩器混勻，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后加體積分數60%乙醇定容至20 mL，測定溶液OD570 nm值，對應亮氨酸濃度繪制標準曲線。試驗測定均重復3次。

1.3 數據分析

使用Excel軟件進行數據統計，采用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析，采用GraphPad Prism 5.0軟件進行繪圖，MEGA 7.0軟件繪制系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 氨基酸產生菌株的初篩

TLC常被用于氨基酸成分的定性分析，簡便、快速、靈敏度高[21-22]，可依據不同極性的物質在層析板上展開條帶的差異進行定性分析，展開劑的選擇對條帶展開效果的影響較大[23]。本研究采用V(異丙醇)∶V(甲酸)∶V(水)=40∶2∶10混合溶液作為展開劑，層析板上條帶顯色情況如圖1。

1-17依次表示：L-酪氨酸(Tyr)、L-甘氨酸(Gly)、L-色氨酸(Trp)、L-組氨酸(His)、L-脯氨酸(Pro)、L-甲硫氨酸(Met)、L-亮氨酸(Leu)、L-異亮氨酸(Ile)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-纈氨酸(Val)、L-丙氨酸(Ala)、L-蘇氨酸(Thr)、L-谷氨酸(Glu)、L-天冬氨酸(Asp)、L-絲氨酸(Ser)、L-賴氨酸(Lys)、L-精氨酸(Arg) 圖1 分離菌株上清液中氨基酸組成Fig.1 Amino acid composition in isolated strains supernatant

除L-甘氨酸(Gly)外，16種氨基酸標準品展開效果較好，條帶顯色清晰，說明展開劑選擇適宜；菌株上清液中明顯展開1 ～ 3種氨基酸，說明該展開劑能夠有效定性菌株上清液中氨基酸成分，其中E1-6、L2-2、S3-3、S3-8、E1-10和E2-4菌株上清液中呈現條帶個數≥2，表明這幾株菌的氨基酸組成更豐富。氨基酸標準品及各菌株顯色條帶的比移值(retention factor value, Rf)如表2所示。

表2 氨基酸標準品及分離菌株上清液中氨基酸的Rf值Table 2 Rf values of amino acid standards and amino acids of isolated strains supernatant

注：“-”表示菌株上清液中不含該種氨基酸

2.2 氨基酸產生菌株復篩

2.2.1 氨基酸標準曲線

依照1.2.8.2方法，測定不同濃度亮氨酸標準液在反應后的OD570 nm值，繪制得到標準曲線，回歸方程為：y=0.0532x+0.001 2，R2=0.996 4。

2.2.2 菌株上清液中游離氨基氮總量的測定

采用茚三酮比色法測定菌株上清液中的游離氨基氮總量，該方法成本低、重復性好[16, 24]，測得反應后溶液的OD570 nm值，根據2.2.1中氨基酸標準曲線計算各菌株上清液中游離氨基氮總量，結果如圖2所示。

圖2 分離菌株上清液中游離氨基氮含量Fig.2 Free amino nitrogen content in isolated strains supernatant注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

菌株L2-2上清液中氨基氮總量顯著高于其他菌株(P<0.05)；菌株E1-10和E1-12上清液中氨基氮總量次之(P<0.05)，均顯著高于其他菌株，這與TLC結果一致，說明該方法雖不能明確區分菌株上清液中含有氨基酸的種類，但能夠快速準確對其氨基酸成分進行定量分析，有效提高了菌株篩選的效率[16, 24]。由此選擇菌株L2-2進行下一步加工特性試驗。

2.3 菌株16S rRNA序列鑒定

對菌株L2-2的基因序列進行PCR擴增，擴增得到的片段約1 500 bp，回收該菌株的PCR擴增產物上機測序，并獲得該菌株的序列文件。測序獲得菌株的序列通過BLAST進行同源性比對，提取相似度≥99%以上的相關比對序列及模式菌株序列，采用MEGA 7.0軟件中NJ法構建系統發育樹。如圖3所示，菌株L2-2與清酒乳桿菌模式菌株(Lactobacillussakeisubsp.sakeistrain ATCC 15521 176)聚類在一起，與清酒乳桿菌(L.sakei)同源性達到99%。因此，菌株L2-2鑒定為清酒乳桿菌；在GenBank提交序列信息獲得基因登錄ID號MK592808.2。

圖3 L2-2菌株16S rRNA系統發育樹Fig.3 16S rRNA phylogenetic tree of L2-2 strain

2.4 菌株耐鹽性試驗

傳統臭鱖魚制品的需鹽量通常為4%～5%(質量分數)，不同的鹽濃度對發酵過程中魚肉蛋白降解程度有差異，并影響其氨基酸風味品質[25]。為確保菌株在魚肉發酵過程中發揮作用，考察菌株的耐鹽性是評價其是否適應加工工藝的指標之一[26]。如圖4所示，菌株L2-2的生長與NaCl質量濃度成反比，與正常生長菌株L2-2相比，NaCl質量濃度為4～8 g/100 mL時，其生長活力顯著降低(P<0.05)；當NaCl質量濃度大于8 g/100 mL，菌株L2-2生長抑制趨于穩定(P>0.05)。BEGANOVIC等[27]對篩選到的菌株進行4%～6% NaCl的耐鹽試驗，指出優良菌株的OD600 nm值在0.4～0.6之間。本研究中，菌株L2-2在質量濃度為4 g/100 mL的NaCl下，生長活力保持較好，OD600 nm為(0.64±0.05)，符合優良耐鹽菌株的標準[27]，表明該菌株能夠適宜臭鱖魚加工需鹽量且維持較好活力。

圖4 菌株L2-2在不同NaCl濃度中的生長活力Fig.4 The growth activity of L2-2 strain in different sodium chloride concentration

2.5 菌株氨基酸脫羧酶試驗

研究表明游離氨基酸在發酵過程中易被微生物產生的特定脫羧酶脫羧形成生物胺，而氨基酸脫羧酶呈陰性的菌株則能夠大大降低發酵制品中生物胺的含量，提高產品的安全性[28]。為確保臭鱖魚制品的安全食用性，對菌株L2-2的氨基酸脫羧酶的活性進行評價。

如表3所示，菌株L2-2精氨酸脫羧酶呈陽性，表明L2-2可能利用精氨酸脫羧產生鯡精胺，作為形成多胺的中間產物之一；其酪氨酸、賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶活性均呈陰性，表明其水解酪氨酸，脫羧賴氨酸產生酪胺、尸胺及直接利用鳥氨酸，分解形成腐胺的可能性較低。由此看出，L2-2菌株通過自身產生氨基酸脫羧酶并形成生物胺的可能性較小。

表3 L2-2菌株的氨基酸脫羧酶活性Table 3 Amino acid decarboxylase activity of L2-2 strain

注：“+”表示反應結果呈陽性，“-”表示反應結果呈陰性

2.6 菌株的抑菌試驗

臭鱖魚的制作是經自然環境發酵，存在產生腐敗致病菌的風險，評價獲得菌株的抑菌特性是確保菌株安全應用于臭鱖魚加工制作的重要指標之一。菌株L2-2屬于乳酸菌，在生長過程中產生的一些細菌素能夠抑制腐敗菌及致病菌[29]。

挑選發酵食品中常用于抑菌試驗的食源性致病菌，且能作為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的代表菌株[13]，分別為Salmonella、E.coli和S.aureus。由表4可知，菌株L2-2對E.coli及S.aureus具有一定抑制作用，抑菌圈直徑分別為8.13和7.58 mm，顯著高于其對Salmonella的抑制作用(P<0.05)。這與前人等[30-31]研究報道相一致，可以確保菌株L2-2在臭鱖魚發酵過程中使用的安全性。

表4 L2-2菌株的抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of L2-2 strain

注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

3 結論

本研究采用傳統微生物培養技術從臭鱖魚中分離得到10株細菌，經復篩得到1株產游離氨基氮總量最高的菌株L2-2，經16S rRNA序列分析鑒定為清酒乳桿菌，具有良好特性，能夠適應傳統發酵臭鱖魚制品現有生產環境條件。此研究為傳統臭鱖魚制品風味菌株的篩選，及解決自然發酵臭鱖魚制品安全性提供了理論依據。