在線二維高效液相色譜法測定發酵食品中的苯乳酸

張雯，林毅侃，黃雨晴，謝佳雨，歐杰,3,4*，李柏林

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(上海市質量監督檢驗技術研究院/國家食品質量監督檢驗中心(上海)，上海，200233) 3(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306) 4(農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海，201306)

苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)是一種小分子化合物，具有廣譜抗菌的性能，能夠抑制某些革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長[1-3]，具有良好的溶解性，在食品中易于擴散，且在較寬pH范圍內能夠保持穩定[1]，有望開發成一種新型的食品抗菌劑。苯乳酸存在于奶酪等乳制品[2]、發酵面團[3]和新西蘭麥盧卡蜂蜜中[4]。可由乳酸菌[5]、白地霉[6]、丙酸桿菌[7]等合成，由于乳酸菌在食品工業中應用普遍且一般公認安全(generally recognized as safe，GRAS)，其作為主要的苯乳酸合成菌株的研究越來越深入并廣泛。苯乳酸能夠隨乳酸菌的發酵生成，近年來有研究顯示，苯乳酸存在于四川泡菜[8]和韓國泡菜中[9]。

目前苯乳酸的檢測方法主要有HPLC法[10-11]、UPLC-MS/MS法[9]、薄層層析法[12]和氣相色譜法[13]。UPLC-MS/MS法設備昂貴，成本較高；氣相色譜法檢測靈敏，但發酵液需凍干后酯化，前處理復雜；HPLC法由于前處理簡單，準確度高，應用較為廣泛。有研究對比了前處理對HPLC法檢測乳酸菌發酵液中苯乳酸的影響，發現樣品通過固相萃取柱后回收率為63.2%，微濾后直接進樣回收率為98.7%，乳酸菌發酵液不適于使用固相萃取柱[14]。以上這些方法主要針對于測定乳酸菌純菌發酵液中的苯乳酸[10,12-14]，而目前對測定食品中苯乳酸含量的研究較少，因發酵食品多為混合菌種發酵[15-16]，成分較多。有研究表明，泡辣椒在發酵過程共產生7類，56種化合物[17]；江米酒中被發現含有乙酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸、蘋果酸和烏頭酸6種有機酸[18]；王娟娟等[19]利用HPLC法在210 nm波長下檢出酸菜含有草酸、蘋果酸、乳酸、乙酸4種有機酸，其中乳酸和乙酸在5～7 min出峰，出峰時間間隔不到1 min，前處理步驟需要進行8 h的離子交換。HPLC法測定苯乳酸的檢測波長為210 nm[14]，如采用傳統HPLC法測定發酵食品中的苯乳酸，可能會有前處理繁瑣、目標峰與雜質峰相連等問題，影響目標峰的辨認，造成定量誤差大。

近年來，在線2D-HPLC法越來越多的應用于復雜體系分析，因其能簡化前處理步驟[20]，改善基質效應[21]，且復雜基質樣品可直接進樣。目標物質與雜質的分離程度對HPLC法檢測至關重要，同時要求良好的靈敏度和重現性。二維色譜峰容量大、與雜質峰的分離程度更好、靈敏度高，能夠提高分離效率，適用于成分較多的發酵食品[22]。2D-HPLC目前廣泛應用于食品領域，有研究利用2D-HPLC檢測奶粉中牛磺酸[23]和脂溶性維生素[24-25]，發現目標峰與雜質分離徹底、前處理步驟少、抗干擾能力強，避免了食品中其他成分對目標峰造成干擾，檢測靈敏，結果準確。

本實驗擬建立一種在線2D-HPLC檢測方法，用于檢測發酵食品中的苯乳酸，并對市售的酸奶、東北酸菜、甜米酒、醬黃瓜和廣式臘腸中苯乳酸的含量進行了測定，并利用UPLC-MS/MS對樣品中的苯乳酸存在性進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PLA標準品(純度>98%)，上海子起生物科技有限公司；甲酸、三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)、乙腈、甲醇(色譜純)，美國Fisher公司；α-淀粉酶，上海普譽科貿有限公司；甜米酒、東北酸菜、廣式臘腸、酸奶、醬黃瓜，上海麥德龍超市。

1.2 儀器與設備

Agilent-1260高效液相色譜儀，配六通閥和柱溫箱，1D-HPLC為Agilent-1260四元泵，可變波長檢測器(Variable wavelength detector，VWD)，2D-HPLC為二元泵，二極管陣列檢測器(Diode array detector，DAD)，美國Agilent公司；ACQUITY H-CLASS 超高液相色譜儀、ACQUITY UPLC Xevo TQ-XS三重四極桿質譜儀，美國Waters公司；SY-601恒溫水浴鍋，天津歐諾儀器儀表有限公司；SL-16超聲波水浴鍋，江蘇盛藍儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確稱取0.01 g PLA 標準品于100 mL容量瓶中，制成100 mg/L的PLA標準儲備液，避光4 ℃儲存。準確吸取標準儲備液稀釋至0.40、0.80、2.00、4.00、10.00 mg/L的標準工作液。

1.3.2 樣品前處理

稱取粉碎均質后的東北酸菜和醬黃瓜各1 g，超純水定容至5 mL，10 000 r/min離心2 min，0.22 μm微濾后進樣。

稱取5 g酸奶加入20 mL水渦旋后，甲醇定容至50 mL，10 000 r/min離心2 min，取離心上清液0.22 μm微濾后進樣。

稱取粉碎均質后的甜米酒5 g和1 g α-淀粉酶共同加入5 mL 超純水中酶解并稀釋，60 ℃下水浴30 min，冷卻后定容至20 mL，9 000 r/min離心2 min，取離心上清液，0.22 μm微濾后進樣。

稱取粉碎后的廣式臘腸5 g加入20 mL水中，后超聲處理，用甲醇定容至50 mL，10 000 r/min離心2 min，取離心上清液，0.22 μm微濾后進樣。

1.3.3 色譜條件

第一維色譜柱：Dikma Diamonsil Plus C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：V(0.1%甲酸水溶液)∶V(甲醇)=65∶35，流速1.0 mL/min；第二維色譜柱：Agilent Poroshell C8色譜柱(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)，流動相：V(0.05%TFA)∶V(乙腈)=87∶13，流速1.0 mL/min，檢測波長：210 nm；進樣體積：20 μL，柱溫：30 ℃。閥切換時間：0.00 min (位置1～6)，4.70 min (位置1～2)，20.00 min(位置1～6)。

使用一維色譜柱對樣品分離，苯乳酸即將通過一維色譜柱時，捕獲柱開始截取與苯乳酸有關的部分，將苯乳酸切換至二維色譜柱，二維色譜柱繼續對樣品分析，此時捕獲柱和一維色譜柱進行平衡清洗。

1.3.4 UPLC-MS/MS色譜和質譜條件

色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1×50 mm，1.7 μm)；流動相A為體積分數0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫，洗脫程序0～1 min 90%A，1～6 min A由90%線性變化至10%，6～8 min 保持10%A，8～10 min由10%線性變化至90%；流速：0.3 mL/min。

質譜分析條件：毛細管電壓：3.0 kV；離子源：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)，負離子檢測模式；檢測方式：質譜多反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)；錐孔電壓：26 V；脫溶劑溫度：400 ℃；脫溶劑氣流量：793～800 L/h；錐孔氣流量：148～150 L/h；霧化氣壓力：630～700 kPa；碰撞氣流量：0.14 mL/min；定量離子對：165>147(m/z)；碰撞能量：15 eV。

2 結果與討論

2.1 一維色譜閥切換時間的確定

在一維條件下將苯乳酸標準品連續進樣，確定苯乳酸標準品的出峰時間在5.0 min。選用高效的C18色譜柱作為一維色譜的分離柱，能夠壓縮縫寬，更好地分離目標峰和雜質峰，縮短閥切換時間窗口，減少一維色譜中雜質進入二維色譜[24]。樣品在第一維色譜柱上進行富集和分離，4.7 min切換六通閥，將苯乳酸切換到第二維色譜條件進行分析定量，使苯乳酸與雜質分開。苯乳酸切換到第二維色譜柱分析時，對第一維色譜柱進行沖洗和平衡，保護色譜柱的性能，由圖1得知，苯乳酸出峰時間為11.0 min。

圖1 苯乳酸標準品2D-HPLC色譜圖Fig.1 2D-HPLC graph of PLA standard

2.2 2D-HPLC法和1D-HPLC法比較

由圖2-a發現，醬黃瓜離心后經0.22 μm微濾進樣，流動相V(0.05%TFA)∶V(乙腈)=75∶25，C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)為固定相進行1D-HPLC分析發現[14]，目標峰與雜質峰相連，且基線不平穩，導致苯乳酸的定性定量不準確，而樣品中雜質過多易對色譜柱造成損耗。

a-醬黃瓜；b-酸奶圖2 樣品1D-HPLC色譜圖Fig.2 1D-HPLC graphs of samples

由圖2-b可知，酸奶在1D-HPLC條件下沒有檢出苯乳酸。研究表明，植物乳桿菌有合成苯乳酸的能力[2,3,8]，而樣品酸奶中含有植物乳桿菌，故推測酸奶中含有苯乳酸。相同樣品在2D-HPLC色譜條件下檢出含有苯乳酸(圖3-c)，表明2D-HPLC方法靈敏度，目標峰分離程度好。

苯乳酸在食品中易于擴散，前處理不當會導致檢測效率低和回收率低等問題。發酵食品中成分較為復雜[17-19]，2D-HPLC法測定苯乳酸降低了食品中雜質成分的干擾、防止了色譜柱污染、延長色譜柱壽命、靈敏度更高。由圖3可知，樣品在2D-HPLC色譜條件下出峰穩定、無雜質干擾，相比1D-HPLC更能滿足檢測需求。

a-醬黃瓜；b-東北酸菜；c-酸奶；d-甜米酒圖3 四種發酵食品中苯乳酸2D-HPLC色譜圖Fig.3 2D-HPLC chromatograms of PLA in four fermented products

2.3 UPLC-MS/MS驗證

苯乳酸在210和258 nm吸收波長下均能出峰[26]，2D-HPLC法檢測苯乳酸時在210 nm下出峰，但在258 nm吸收波長下無色譜峰出現，為驗證使用2D-HPLC法時,210 nm處色譜峰為苯乳酸目標峰，本實驗采用UPLC-MS/MS進行樣品的驗證。由圖4可知，醬黃瓜、東北酸菜、酸奶和米酒中有苯乳酸存在，驗證了2D-HPLC法在210 nm下色譜峰為苯乳酸目標峰。

a-苯乳酸標準溶液；b-醬黃瓜；c-酸菜；d-酸奶；e-甜米酒圖4 四種發酵食品多反應監測色譜圖Fig.5 MRM chromatograms of four fermented products

2.4 線性方程、檢出限和定量限

本實驗采用外標法對苯乳酸進行定量檢測，通過分析5種濃度(0.40、0.80、2.00、4.00和10.00 mg/L)的標準品溶液，以標準品濃度為x軸，以峰面積為y軸，計算回歸方程和系數。檢出限定義為信噪比(RSN)為3時對應的質量濃度，定量限定義為RSN為10時對應的質量濃度。在1.3.3的色譜條件下，儀器平衡1 h后，儀器基線噪聲為0.80 mAu。

標準溶液濃度對應峰面積見表1，回歸方程y=290.29x+7.59且r>0.999 9，該方法在0.40～10.00 mg/L內有良好的線性。使用0.40 mg/L的標準溶液測定檢出限和定量限，分別為0.16和0.52 mg/L，表明該方法靈敏度高，能夠滿足檢測需要。

表1 線性回歸方程、檢出限和定量限Table 1 Regression equation, LOD and LOQ of PLA reference solution

2.5 發酵食品中苯乳酸含量測定和回收率實驗

對醬黃瓜、東北酸菜、酸奶、甜米酒、臘腸加標測定回收率，分別向樣品中分別加入低、中、高3個水平的苯乳酸標準品(即加入折合質量濃度為0.40、0.80和2.00 mg/L的標準品)，按照1.3.3的條件進行2D-HPLC分析考察方法的回收率，每組6個平行。同時測定5種發酵食品中苯乳酸的含量，得出本方法回收率在91.79%～107.37%，RSD<15%，符合國家標準[27]。

由表2知，醬黃瓜、東北酸菜、酸奶、甜米酒能夠檢出苯乳酸，臘腸中未能檢出苯乳酸。經測定東北酸菜和酸奶中苯乳酸含量分別為5.50和1.57 mg/L，市售東北酸菜和酸奶配料表中標識添加植物乳桿菌，未標識添加苯乳酸，苯檢出的乳酸可能由乳酸菌發酵合成。醬黃瓜苯乳酸含量為8.01 mg/L，醬黃瓜無乳酸菌和苯乳酸添加標識，可能在腌制的無氧環境下有乳酸菌參與發酵，代謝生成苯乳酸。甜米酒中苯乳酸含量為9.08 mg/L，配料表中未標識添加乳酸菌和苯乳酸，但研究表明米酒中含有乳酸菌[28-29]，檢出的苯乳酸可能是由米酒中乳酸菌合成。廣式臘腸中未檢出苯乳酸，可能由于乳酸菌在廣式臘腸中生長代謝更趨向于降解亞硝酸鹽，有研究表明，乳酸菌通過合成酸類物質促進亞硝酸鹽的降解[27]。

表2 樣品中的苯乳酸含量和回收率實驗Table 2 PLA concerntration in five samples and recovery test

2.6 重復性試驗

制備6份2.00 mg/L標準溶液，在1.3.3所述色譜儀條件下，在日內和日間(24 h后)分別進樣，測定并計算峰面積平均值和RSD。

重復性以RSD表示，表3結果顯示該方法日內和日間重復性較好，RSD分別為0.60%和0.94%，能夠滿足檢測要求。

表3 儀器精密度和重復性實驗Table 3 Repeatability test of the PLA reference solution

3 結論

本實驗建立了一種2D-HPLC檢測發酵食品中苯乳酸的方法，該方法相比傳統1D-HPLC法靈敏度高，目標峰與雜質峰分離徹底。利用本方法測定5種發酵食品的加標回收率為91.79%～107.37%，檢出限和定量限分別為0.16和0.52 mg/L，能夠滿足檢測需求，同時本實驗利用UPLC-MS/MS法進一步驗證了樣品中苯乳酸的存在性。本方法前處理步驟簡單，適當稀釋沉淀蛋白后即可進樣；檢測效率高、重復性好、結果準確，減少了雜質帶來的影響；能夠快速簡便地檢測出食品中的苯乳酸，適用于大批量樣品的檢測。

本實驗利用2D-HPLC法測定出東北酸菜、醬黃瓜、甜米酒和酸奶中含有苯乳酸，其中甜米酒和醬黃瓜中的苯乳酸含量較高。苯乳酸的存在與微生物生長相關，篩選甜米酒和醬黃瓜中的苯乳酸合成菌有待進一步研究。在后續研究中可通過調整流動相洗脫方式，一次性檢出多種組分。本方法也為2D-HPLC法測定發酵食品中其他組分提供參考和理論依據。