尋常型銀屑病患者外周血髓系樹突狀細胞CD47的表達

錢 青 高春巖 申宇鴻 宋世珅 郭乃洲 高 雯

1北京市和平里醫(yī)院，北京，100013；2鹽城市第一人民醫(yī)院，鹽城，224000

尋常型銀屑病的免疫機制是過度增生的角質形成細胞、炎性樹突狀細胞、嗜中性粒細胞、肥大細胞和T細胞之間相互作用，Th17與調節(jié)性T細胞(Treg)失衡，導致皮膚慢性紅斑、鱗屑樣炎癥性病變[1]。在Th17/Treg細胞分化過程中，樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)作為一種重要的抗原提呈細胞發(fā)揮重要的作用。DCs細胞表面整合素相關蛋白(integrin-associated protein，IAP或CD47)與其配體血小板反應蛋白-1(Thrombospondin-1, TSP-1)結合可抑制DCs分化成熟，降低炎性細胞因子的分泌，誘導Treg分化，抑制機體的炎癥反應[2,3]。但尋常型銀屑病患者外周血髓系樹突狀細胞(myeloid DCs, mDCs)CD47表達水平及其功能缺乏研究，本次研究通過檢測銀屑病患者外周血mDCs表面CD47表達水平，并通過體外實驗，用CD47配體TSP-1結合單核細胞誘導形成的mDCs，分析其調節(jié)Treg細胞分化的能力，探討其在銀屑病疾病中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2018年4月至2019年6月于我院皮膚科門診就診的尋常型銀屑病患者46例，其中男24例，女22例，年齡20～58(36.2±11.4)歲，均為進行期患者。銀屑病診斷標準及分類參照《中國銀屑病治療指南(2008版)》[4]。排除標準：2個月內服用免疫抑制劑、維A酸制劑，系統應用糖皮質激素治療；伴有關節(jié)炎、天皰瘡、皮肌炎等自身免疫性疾病；感染或其他炎癥疾病。健康對照者為本院健康體檢人群，均無炎癥性和自身免疫性疾病，其中男24例，女22例，年齡22～56(37.1±10.8)歲，兩組性別和年齡差異無統計學意義。本次研究經本院倫理委員會批準，受試者知情同意。

1.2 儀器和試劑 Ficoll淋巴細胞分離液購自天津灝揚生物公司，RPMI1640細胞培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco公司。重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)及重組人白細胞介素-4(rhIL-4)均購自Peprotech公司。異硫氰酸熒光素(FITC)-鼠抗人Lin-1單克隆抗體(mAb)購自BD公司、別藻青蛋白(APC)-鼠抗人CD11c mAb和葉綠素蛋白(PerCP)-cy5.5鼠抗人HLA-DR均購自Biolegend公司。CD47采用藻紅蛋白(PE)-鼠抗人mAb。美國BD Canto II流式細胞分析儀檢測mDCs細胞表面CD47平均熒光強度(MFI)，作為CD47表達水平。CD4+T細胞陰性分選磁珠購自德國Miltenyi Biotec公司。hTSP-1購自Abcam公司。anti-CD3購自BD Biosciences公司。APC-鼠抗人CD25、FITC-鼠抗人CD4和PE-鼠抗人FoxP3均購自BD公司。白細胞介素(IL)-23、IL-17和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor, TNF-α)檢測試劑購自Bio-rad公司。CD47過表達質粒由上海漢恒生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 患者抽血前評估銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(PASI)，得分為5.8～20.2(14.2±4.8)。銀屑病患者和健康志愿者在空腹條件下采集肘部靜脈血20 mL，肝素鈉抗凝，其中0.5 mL用于流式細胞檢測mDCs CD47表達，其余用于分離單核細胞，誘導成mDCs。

1.3.2 流式細胞術檢測mDCs細胞CD47表達水平 取100 μL肝素抗凝靜脈血，加入10 μL FITC-鼠抗人Lin-1mAb、10 μL APC-鼠抗人CD11c mAb、PerCP-cy5.5鼠抗人HLA-DR mAb和10 μL PE-鼠抗人CD47 mAb，室溫避光孵育30 min，然后用紅細胞裂解液去除紅細胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)洗滌，并用400 μL PBS緩沖液重懸，mDCs定義為HLA-DR+Lin-1-CD11c+細胞。流式分析儀檢測以HLA-DR+Lin-細胞設門，檢測HLA-DR+Lin-CD11c+細胞表面CD47 平均熒光強度。

1.3.3 單核細胞誘導mDCs 取受試者肝素鈉抗凝血19 mL，經Ficoll密度梯度離心分離制備單個核細胞，貼壁法分離單核細胞，細胞濃度用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調整為5×106/L，置6孔培養(yǎng)板，37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加入500 U/mL rhGM-CSF和10 ng/mL rhIL-4，誘導單核細胞分化，隔二日半量換液，6天后收集懸浮的細胞，即誘導的mDCs。分兩份，其中一份經pYr-ads-4-hCD47質粒轉染，上調CD47表達。

1.3.4 重組質粒上調銀屑病患者mDCs CD47表達 用RPMI 1640培養(yǎng)液將3 μL Lipofectamine 2000脂質體和2 μg pYr-ads-4-hCD47質粒分別稀釋至200 μL，然后將兩者混勻，混合物在室溫條件下孵育20 min，形成質粒轉染應用液。上述誘導的mDC，用RPMI 1640培養(yǎng)液將濃度調到4×105/mL，體積為200 μL，然后加入質粒轉染應用液200 μL，置于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中孵育5 h，更換為含有10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液。轉染效果用流式細胞儀檢測細胞CD47表達水平。

1.3.5 CD4+T細胞制備 留取健康孕婦足月分娩的臍帶血，通過密度梯度離心獲得外周血單個核細胞，然后使用CD4+分選磁珠分離CD4+T細胞。采用流式細胞術進行檢測分離提純的細胞，CD4+細胞純度大于95%。

1.3.6 mDCs與CD4+T細胞共培養(yǎng) 取上述誘導的健康對照者mDCs、銀屑病患者mDCs和過表達CD47的銀屑病患者mDCs，與CD4+T細胞在24孔板以1∶10比例共培養(yǎng)，反應體系中加入5 μg/mL TSP-1和1 μg/mL anti-CD3，在37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，收集細胞，流式細胞術檢測CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞比例；收集上清液，檢測細胞因子IL-23、TNF-α濃度。

1.3.7 CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞檢測 收集100 μL共培養(yǎng)細胞，加入10 μL APC-鼠抗人CD25和10 μL FITC-鼠抗人CD4，避光孵育20 min。反應體系中加入250 μL Fix/Perm緩沖液，孵育40min，經300 μL Perm/wash緩沖液洗滌，并用100 μL Perm/wash重懸細胞。加10 μL PE-鼠抗人FoxP3，避光孵育30min。PBS洗滌后重懸細胞，流式細胞儀以CD4+CD25+細胞設門，檢測CD4+CD25+FoxP3+細胞占CD4+細胞比例。

1.3.8 Luminex檢測細胞因子濃度 收集共培養(yǎng)上清液，按試劑說明書檢測IL-23和TNF-α濃度，每個標本檢測兩次，取均值。

1.4 統計學方法 全部數據經Stata 7.0統計軟件處理，計量資料均為正態(tài)性分布，均數±標準差表示，經students’ t-test作雙側檢驗，相關性分析采用Pearson檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞術檢測外周血mDCs表面CD47表達水平 流式細胞術檢測外周血mDCs表面CD47表達水平(圖1)，與健康對照組相比，銀屑病患者外周血mDCs細胞CD47表達水平顯著降低(32.8±10.3 vs 63.6±12.5)，差異有統計學意義(t=13.2,P<0.001)。見圖2。

2.2 銀屑病患者外周血mDCs CD47表達水平與PASI相關性分析 銀屑病患者外周血mDCs細胞CD47表達水平與PASI負相關(r=-0.651,P<0.05)。見圖3。

2.3 誘導的mDCs與淋巴細胞共培養(yǎng)上清液細胞因子檢測 與健康對照組相比，銀屑病患者組單核細胞誘導的mDCs細胞與淋巴細胞共培養(yǎng)上清液中IL-23、TNF-α濃度顯著上升，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

2.4 誘導的mDCs與CD4+細胞共培養(yǎng)誘導Treg分化 流式細胞術檢測CD4+CD25+FoxP3+細胞占CD4+細胞比例(圖5)，與健康對照組相比(n=46)，銀屑病患者單核細胞誘導的mDCs細胞(n=46)和CD4+淋巴細胞共培養(yǎng)，誘導的Treg細胞比例顯著降低(3.8±1.4% vs 6.2±2.1%)，差異有統計學意義(t=6.5,P<0.001)。

1a：HLA-DR+Lin-細胞；1b：HLA-DR+Lin-CD11c+細胞；1c：mDCs CD47 MFI圖1 流式細胞術檢測外周血mDCs表面CD47表達水平

圖2 外周血mDCs表面CD47 MFI比較 圖3 銀屑病患者mDCs CD47 MFI與PASI相關性分析 圖4 共培養(yǎng)上清液細胞因子濃度 (pg/mL)

注：*P<0.05 銀屑病未轉染CD47組vs銀屑病轉染CD47組

2.5 重組質粒過表達CD47的mDCs細胞與CD4+細胞共培養(yǎng) 轉染人CD47重組質粒上調銀屑病患者mDCs細胞CD47表達。與銀屑病未轉染組相比，銀屑病轉染CD47組mDCs細胞與CD4+細胞共培養(yǎng)上清液中IL-23和IL-17濃度顯著降低，誘導CD4+Treg分化顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

3 討論

在銀屑病的疾病過程中，DCs異常活化是銀屑病發(fā)病機制中的上游環(huán)節(jié)[5]，在銀屑病患者的皮損真皮層中，浸潤的炎性CD11c+髓系DC數量與正常皮膚相比顯著增加，并異常活化，分泌大量誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、TNF-α和IL-23等炎性細胞因子，進一步激活T淋巴細胞，誘導Th1、Th17細胞擴增，是銀屑病發(fā)病的重要因素[6]。mDCs細胞由單核細胞分化而來，在疾病狀態(tài)角質形成細胞通過分泌趨化因子CCL20募集大量CCR6+的mDCs到病損部位，維持炎癥反應[7]。在小鼠銀屑病模型中，通過使用中和抗體去除mDCs的前體即單核細胞，小鼠疾病嚴重程度顯著降低，表明mDCs在維持銀屑病癥狀發(fā)揮重要作用[8]。

CD47分子是一種分布于細胞表面的信號受體，與TSP-1結合可抑制DCs細胞成熟和分泌炎癥細胞因子，降低機體免疫系統對損傷的應答[9]。動物模型證實，CD47缺陷小鼠經免疫致敏物質刺激后，誘導的炎癥反應持續(xù)時間顯著長于野生型小鼠，機制是DCs細胞CD47信號轉導通路抑制T細胞的激活，從而降低炎癥反應[10]。本次研究表明，銀屑病患者外周血mDCs表面CD47表達顯著降低，且和疾病嚴重程度負相關。Rodríguez-Jiménez等[11]證實銀屑病患者外周血CD4+細胞CD47 mRNA和mDC CD47表達降低，單核細胞體外誘導形成的mDCs細胞TSP-1 mRNA表達降低。上述研究均表明，銀屑病患者mDCs細胞CD47信號通路表達降低。

銀屑病mDCs主要通過產生細胞因子TNF-α和IL-23參與銀屑病炎癥。與健康人群相比，銀屑病患者的病變皮膚和血清中均檢測到TNF-α水平升高。TNF-α是IL-23/IL-17信號途徑的上游細胞因子[1]，可與IL-17等細胞因子協同作用而增強促炎活性，使用TNF-α阻斷劑可改善銀屑病患者臨床癥狀，并減少病損組織的IL-17濃度[12]。此外，阻斷IL-23也可產生非常有效的臨床結果，證明IL-23是銀屑病的關鍵細胞因子[13]。本次研究證實，銀屑病患者單核細胞誘導的mDCs分泌高濃度的IL-23和TNF-α。

mDCs產生的IL-23聯合IL-1β可誘導CD4+幼稚細胞向Th17分化，向Treg細胞分化降低[14]。Treg細胞是機體抑制炎癥反應、維持自身免疫耐受的重要免疫細胞。臨床研究證實，銀屑病患者血液中IL-23濃度增加，誘導CD4+T細胞向Th17細胞分化，抑制Treg細胞分化[15]，導致銀屑病患者外周血和皮膚中Treg細胞均降低[16,17]。本次研究表明，銀屑病患者單核細胞誘導的mDCs與淋巴細胞共培養(yǎng)，誘導Treg細胞比例顯著低于健康對照組。重組質粒過表達銀屑病患者mDCs細胞CD47，誘導的Treg細胞顯著升高，分泌IL-23和IL-17顯著降低。上述研究表明，銀屑病患者mDCs CD47表達降低與其分泌促炎細胞因子升高有關，通過上調CD47表達可抑制此病理過程。

綜上所述，本次研究表明銀屑病患者外周血mDCs細胞CD47表達顯著降低，并與PASI負相關。通過體外實驗證實，銀屑病患者外周血單核細胞誘導的mDCs分泌高濃度的炎性細胞因子IL-23和TNF-α，誘導CD4+Treg分化的功能顯著降低，通過重組質粒上調mDCs細胞CD47表達可阻斷此作用。因此，mDCs細胞CD47低表達可能在銀屑病患者疾病過程中發(fā)揮重要作用，調控mDCs細胞CD47信號通路可能是尋常型銀屑病治療的新途徑。