PD-L1在皮膚鱗狀細胞癌及角化棘皮瘤中的表達

胡 婕 陳 偉 盧 平 程雙華 李 燦

成都醫學院第二附屬醫院，核工業四一六醫院，四川成都，610051

皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC)起源于表皮或附屬器的角質形成細胞，是常見的非黑素瘤皮膚惡性腫瘤之一[1]，患者行手術切除后5年生存率高于90%，但易發生侵襲和轉移[2]。而角化棘皮瘤(keratoacanthoma，KA)是一種少見的皮膚鱗狀細胞增生性腫瘤，具有生長快、可自行消退的特點，它在臨床表現及組織病理學上與高分化的cSCC難以區分。KA究竟是cSCC的特殊類型還是一種獨立的皮膚腫瘤，目前還存在爭議。程序性死亡因子配體-1(programmed death factor ligand-1, PD-L1)在多種腫瘤細胞中高表達[3-5]，是目前免疫治療最重要的生物學標志物。本研究通過免疫組化染色(IHC)檢測PD-L1在cSCC和KA中的表達情況，分析其與cSCC和KA臨床病理參數的關系，初步探討PD-L1在cSCC發生、發展中的作用，為cSCC的免疫治療尋找新靶點，并分析PD-L1能否有效區分cSCC和KA。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年2月至2019年12月在我院皮膚科行手術治療的皮膚鱗狀細胞癌及角化棘皮瘤患者共88例。cSCC共56例，男37例，女19例，年齡33～79歲，平均(65.78±11.93)歲。根據Broders病理分級分組：I組(I級)34例，II/III組(II級/III～IV級)22例。伴有淋巴結轉移38例，無轉移18例。腫瘤位置：曝光部位(面、頸)30例，非曝光部位(背、胸、四肢及會陰)26例。KA共32例，男18例，女14例，年齡46～84歲，平均(66.64±9.05)歲。腫瘤位置：曝光部位(面、頸)21例，非曝光部位(前胸、四肢及會陰)11例。另選取同期在我院行美容整形手術的32例正常皮膚組織切片作為對照組。各組在性別、年齡方面無統計學差異(P>0.05)。

1.2 納入與排除標準 納入標準：(1)標本均來源于手術完整切除的瘤體；(2)所有患者均為首次發病，術前未行其他治療；(3)患者病歷資料完整，年齡、性別、皮損部位不限；(4)所有受試者知情同意。排除標準：(1)來源于皮膚活檢的標本；(2)合并其他腫瘤或相關疾病者；(3)合并心腦血管、自身免疫性疾病不能耐受手術者；(4)組織病理學診斷不明確者。

本研究患者或家屬簽署知情同意書，且研究方法遵循倫理學規定，上報本院倫理委員會審核批準。

1.3 研究方法

1.3.1 主要試劑與儀器 免疫組化染色試劑盒(SP法)購于邁新公司，貨號：191212s457m；兔抗人PD-L1一抗購于DAKO公司；貨號：M3653；EG1150H石蠟包埋機、RM2235石蠟切片機均購于Leica公司；光學顯微鏡型號為Nikon50i。

1.3.2 免疫組織化學法檢測PD-L1表達 將保存的石蠟切片脫蠟、水化后，采用免疫組化SP法檢測組織切片中PD-L1蛋白的表達，具體按照全自動免疫組化染色機(Titan，邁新)的標準化操作流程進行。

PD-L1染色結果判斷：采用半定量分級法，綜合染色強度和陽性細胞百分比積分。每張病理組織切片的全部視野均需觀察：(1)染色強度分級：0分(無著色)，1分(淡黃色)，2分(棕黃色)，3分(棕褐色)；(2)陽性細胞百分比分級：0分(<5%)，1分(5%～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4分(>75%)。最終得分=染色強度分級評分×陽性細胞百分比分級評分，結果分為4組：<2分，陰性(-)；2～3分，弱陽性(+)；4～6分，陽性(++)；>6分，強陽性(+++)。由兩位病理科資深醫師采用盲法進行打分。

1.4 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件分析，計量資料用均數±標準差表示，采用t檢驗法對各組計量數據進行統計學比較；計數資料采用“%”表示，采用χ2檢驗法對各組計數數據進行統計學對比，當n<40，且有格子的理論頻數<5時，采用Fisher確切概率法直接計算累計概率。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PD-L1在各組中表達情況的比較 PD-L1在cSCC組的陽性率(66.07%)及KA組中的陽性率(62.50%)均顯著高于正常對照組(9.38%)，差異有統計學意義(P<0.05)，但cSCC與KA組間的差異沒有統計學意義(P>0.05)(表1、圖1)。

注：cSCC組vs正常對照組：P<0.01;KA組vs正常對照組：P<0.01;cSCC組vs KA組：χ2=1.240，P>0.05

2.2 PD-L1在皮膚鱗狀細胞癌組內表達情況的比較 PD-L1在Broders分級分組II/III組中的陽性率(81.82%)高于I組(55.88%)，斯皮爾曼相關系數為-0.412，說明PD-L1的表達與cSCC的分化程度呈負相關，即cSCC分化越差PD-L1表達越強，分化越好PD-L1表達越弱，其差異有統計學意義(P<0.05)(表2、圖2)。

表2 PD-L1在cSCC組內表達情況的比較

注：χ2=9.354，P<0.05；斯皮爾曼相關系數為-0.412，P<0.01

3 討論

程序性死亡受體-1(programmed death-1，PD-1)又名CD274，是一種50～55KD的I型跨膜糖蛋白，屬于B7/CD28協同刺激分子超家族的重要成員。正常情況下，PD-1在活化的CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B細胞、單核細胞和DC表面廣泛表達，對維持機體的免疫耐受有重要作用[6]。而在惡性腫瘤的發生過程中，淋巴細胞表面的PD-1與腫瘤細胞表面的PD-L1結合形成PD-1/PD-L1信號通路，通過激活SHP-2，抑制Zap70蛋白的磷酸化水平，上調ERK等蛋白表達，進而釋放NF-κB因子，降低腫瘤局部微環境中T細胞的免疫效應[7]，介導腫瘤細胞逃逸，并與腫瘤的浸潤、轉移相關[8]。有針對性的阻斷PD-1/PD-L1通路，可以增強T細胞對腫瘤細胞的殺傷。近年來，PD-1和PD-L1抑制劑逐漸應用于非小細胞型肺癌(NSCLS)、腎細胞癌、皮膚黑素瘤和默克爾細胞癌等多種惡性腫瘤，并且取得了良好的治療效果，一時之間PD-L1作為腫瘤免疫治療重要的生物學標志而備受關注，但關于cSCC和KA的報道少見。

1a,1b:cSCC I組(HE,×40;IHC,×100);1c,1d:KA組(HE,×40;IHC,×100)圖1 PD-L1在cSCC組和KA組中表達的情況

2a:cSCC I組(HE，×200);2b:cSCC II組(HE，×200);1c:cSCC III組(HE，×200);2d:cSCC I組(IHC，×400);2e:cSCC II組(IHC，×400);2f:cSCC III組(IHC，×400)圖2 PD-L1在cSCC不同分級組內表達情況

cSCC來源于表皮或附屬器角質形成細胞，又稱為棘細胞癌，好發于日光損傷部位，易發生侵襲和轉移，治療主要依靠手術切除或者放療。目前研究認為cSCC的發病機制與紫外輻射、免疫抑制等多因素有關，腫瘤細胞通過抑制T細胞活性，釋放免疫炎癥因子等方式逃避機體免疫系統的監測，進而不斷增殖，加速腫瘤進展[9]。T細胞浸潤在cSCC中普遍存在，T細胞受體與配體間的相互作用后可調控T細胞對腫瘤細胞的免疫效能。深入探究影響cSCC的免疫機制，對尋找cSCC的免疫治療靶標具有重要的作用。本研究發現PD-L1在cSCC患者腫瘤組織中陽性表達率為66.07%，顯著高于正常對照組的9.38%(P<0.05)，這表明PD-1/PD-L1信號通路介導的免疫抑制可能參與了cSCC的發病。同時我們發現PD-L1的表達與cSCC的組織病理分化程度呈負相關，即cSCC分化越差PD-L1表達越強，分化越好PD-L1表達越弱，這一結果提示cSCC患者的治療方案除了選擇手術切除或放療以外，在不遠的未來還可能會依據腫瘤組織中PD-L1表達的情況，為患者選擇個體化的治療方案。針對PD-1/PD-L1的免疫治療藥物已逐步應用于宮頸癌、頭頸部鱗狀細胞癌及食管癌等腫瘤的治療中，我們的研究表明PD-L1可能成為cSCC免疫治療的新靶點。

KA是一個具有爭議的腫瘤實體，絕大多數KA發生在有毛發的皮膚，從而推測KA來源于毛囊上皮細胞，它的消退可能與毛囊周期有關。cSCC和KA無論是臨床表現還是組織病理學表現都非常相似，特別是高分化的cSCC和KA之間鑒別困難。最初認為KA是一種伴有明顯角化的上皮良性增生性病變，可自愈，生長迅速，數月后可自行消退，不需手術治療[10]，部分學者認為KA具有獨特的臨床和組織學特征，應是一種獨立存在的疾病[11]。但是隨著研究的深入，又發現KA有潛在的癌變傾向，少數可惡變為cSCC，卻極少發生遠處轉移[12]，因此2004年Hurt等[13]提出KA是cSCC的一種亞型，應將其定義為高分化鱗狀細胞癌(角化棘皮瘤型)。在2006版WHO皮膚腫瘤病理學和遺傳學中KA被歸入棘皮瘤，ICD-O編碼：8071/1[14]，而2018版WHO中KA被首次歸入鱗狀細胞癌，ICD-O編碼由8071/1變更為8071/3，這表明其生物學行為由良性或惡性未肯定，明確修訂為惡性[15]，同義詞包括：高分化鱗狀細胞癌(角化棘皮瘤型)、角化棘皮瘤樣鱗狀細胞癌。這似乎表明KA應視為cSCC的一種特殊類型，但是2018版WHO依舊保留了“角化棘皮瘤”這個診斷，并且提出雖然cSCC和KA擁有同樣的致癌基因MAP3K8(TPL2)，但是KA與cSCC的遺傳學特征仍存在不同[15]。Ra等[16]的研究也證實KA特有的基因表達譜系分析提示其與鱗狀細胞癌在分子上是不同的。雖然目前已有研究提出Ki-67[17]、bcl-2[18]、p53等生物分子表達的差異可能有助于區分cSCC和KA，但尚未發現具有高度特異性和敏感性的分子標志物。本研究發現PD-L1在KA腫瘤細胞表達的陽性率為62.50%，顯著高于正常對照組(P<0.01)，這說明PD-1/PD-L1信號通路上調可能也參與了KA的發病，但PD-L1在cSCC組與KA組的表達差異沒有統計學意義(P>0.05)，因此PD-L1仍舊不能有效的區分cSCC和KA。

綜上所述，PD-L1在腫瘤細胞中表達上調，引起腫瘤微環境中免疫監視功能的降低，從而使腫瘤細胞發生免疫逃逸，PD-1/PD-L1信號通路可能參與了cSCC和KA的發病。PD-L1與cSCC的分化程度呈負相關，分化越差PD-L1表達越強，PD-L1可能成為cSCC免疫治療的一個新靶點。PD-L1在cSCC和KA中的表達沒有差異性，更為支持KA可能是cSCC的一種特殊類型。由于本研究納入的病例數量較少，且目前對于PD-L1免疫組化染色結果的判讀尚未達成廣泛共識，這可能會對結果造成一定的影響，因此后期仍需擴大樣本量，繼續積累經驗，力爭為cSCC和KA的診療提供更加充分、全面的論據。