生物法制造丁二酸研究進(jìn)展

張耀，邱曉曼，陳程鵬，于卓然，洪厚勝，3

（1 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211816； 2 南京工業(yè)大學(xué)國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心，江蘇南京211816； 3 南京匯科生物工程設(shè)備有限公司，江蘇南京210009）

引 言

丁二酸（succinic acid）又名琥珀酸，是TCA 循環(huán)的中間產(chǎn)物之一。丁二酸被美國(guó)能源部列入“十二種生物基平臺(tái)化合物”名單，并被認(rèn)為具備取代石化產(chǎn)品中間體成為新一代生物基化學(xué)品中間體的潛力[1-2]。近二十年來，通過研究已得到了多株不同菌種的高產(chǎn)丁二酸菌株。基于這些菌株及其配套工藝，國(guó)內(nèi)外已有多家企業(yè)建成了生物基丁二酸工廠。這些工廠在生產(chǎn)菌株、發(fā)酵及分離工藝等多方面都存在著差異。本文將結(jié)合生物基丁二酸的產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀，將生產(chǎn)菌株與發(fā)酵及分離工藝結(jié)合起來，綜合分析發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸經(jīng)濟(jì)可行的方案。

1 產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀

近年來丁二酸的產(chǎn)量保持著穩(wěn)步增長(zhǎng)。全球丁二酸市場(chǎng)產(chǎn)量已從1999 年的1.5 萬噸增加至2015 年的5.85 萬噸，其市場(chǎng)規(guī)模也上升至1.52 億美元[3-4]。根據(jù)產(chǎn)業(yè)預(yù)測(cè)，這一市場(chǎng)在2021年將可能達(dá)到7.5 億美元[5]。市場(chǎng)上的丁二酸目前主要依賴于石化法合成，但近年來由于石油價(jià)格波動(dòng)較大，預(yù)計(jì)石化法合成丁二酸產(chǎn)量將趨于穩(wěn)定[6]。未來，作為價(jià)格穩(wěn)定且經(jīng)濟(jì)可持續(xù)的丁二酸制造方法，生物法將主要承擔(dān)著丁二酸市場(chǎng)的增量產(chǎn)能[7]。目前全球多家公司的丁二酸生物工廠已經(jīng)投產(chǎn)，它們?cè)谑袌?chǎng)上能否與石化法競(jìng)爭(zhēng)，很大程度上將取決于未來丁二酸的市場(chǎng)需求和生物基丁二酸的制造成本。

1.1 化學(xué)法制造丁二酸生產(chǎn)工藝

由于石油化學(xué)工業(yè)成熟的生產(chǎn)工藝體系，化學(xué)法生產(chǎn)的丁二酸在經(jīng)濟(jì)性上目前仍優(yōu)于生物法，市場(chǎng)上丁二酸仍主要來源于化學(xué)合成[8]。丁二酸的化學(xué)合成方法包括石蠟氧化法、催化加氫法、電解合成法。石蠟氧化法是生產(chǎn)丁二酸的傳統(tǒng)方法，但丁二酸只是石蠟氧化的副產(chǎn)物，所以該方法生產(chǎn)的丁二酸總量有限[7]。電解合成法目前仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，研究人員[9-10]嘗試通過使用合適的電極材料及催化劑以提高反應(yīng)中電流效率并降低反應(yīng)成本，但這些方法都未解決電極材料和設(shè)備損耗大以及副產(chǎn)物含量高的問題，所以此方法距離實(shí)際工業(yè)應(yīng)用仍有一段距離[11]。目前市面上多數(shù)丁二酸仍通過催化加氫法合成。該方法以順丁烯二酸酐為原料，順丁烯二酸酐在加氫反應(yīng)器中經(jīng)Ni 或Pb 催化還原后，再經(jīng)水化得到丁二酸。該反應(yīng)雖然轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量高，但存在工藝復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻、催化劑價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。

1.2 生物基丁二酸工廠的生產(chǎn)工藝

近年來，隨著包括石油化工巨頭BASF 在內(nèi)的多家公司建成了多條生物基丁二酸生產(chǎn)線，生物基丁二酸的產(chǎn)量也在穩(wěn)步增長(zhǎng)。如表1 所示，這些廠家所用的生產(chǎn)菌株不盡相同，依據(jù)菌株差異也采用了不同的發(fā)酵及分離純化工藝。Reverdia 公司（DSM 和Roquette 合資）的丁二酸工廠位于意大利，該生產(chǎn)線技術(shù)特點(diǎn)在于他們將一種產(chǎn)丁二酸的重組酵母（S.cerevisiae）作為生產(chǎn)菌株，在低pH 條件下進(jìn)行好氧發(fā)酵。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于丁二酸在低pH處于非解離狀態(tài)，無須調(diào)節(jié)pH，分離提取時(shí)可采取直接結(jié)晶的工藝，使下游分離成本大幅減低。BioAmber 早期的工廠是將大腸桿菌（E.coli）用作生產(chǎn)菌株，使用電透析法回收丁二酸。后來BioAmber和Mitsubishi 合資的工廠采用酵母Candida krusei進(jìn)行低pH 發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。Succinity 公司（BASF 與Purac合資）的生產(chǎn)線采用的是一種從牛瘤胃中分離出的新型丁二酸生產(chǎn)菌株Basfia succiniciproducens，該菌株屬于巴斯德菌科，擁有利用三碳、五碳和六碳糖能力，也具備很好的固碳能力[12-13]。Succinity在發(fā)酵工藝上也創(chuàng)新地使用Mg(OH)2維持pH，該方法能提高發(fā)酵液中Mg2+的濃度以增加丁二酸產(chǎn)量[14]。Myriant 則將一株能利用木質(zhì)纖維素水解液的大腸桿菌（E. coli）用作生產(chǎn)菌株，使用氨水作pH 調(diào)節(jié)劑，并選擇氨沉淀法分離丁二酸[15]。

1.3 丁二酸的衍生物

作為平臺(tái)化合物，丁二酸能通過化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為1,4-丁二醇(1,4-BDO)、γ-丁內(nèi)酯（GBL）、四氫呋喃（THF）等多種大宗化學(xué)品[16-17]。研究者們還開發(fā)出多種非均相金屬催化劑，以使發(fā)酵液中的丁二酸直接轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物[18]。而丁二酸的巨大市場(chǎng)潛力就在于它能否作為前體合成許多大宗化學(xué)品。這很大程度上取決于它在生產(chǎn)價(jià)格上能否與石化產(chǎn)品中間體——順丁烯酸酐競(jìng)爭(zhēng)，由于石油價(jià)格上漲該化學(xué)品的價(jià)格已增長(zhǎng)了三倍[19]。但礙于生產(chǎn)工藝所限，生物基丁二酸的生產(chǎn)成本目前仍然較高，且各類衍生物合成路徑在成本上也無法對(duì)石化法路徑構(gòu)成威脅，所以生物基丁二酸仍不具備取代石化中間體的實(shí)力。這也使丁二酸目前主要被用作食品酸化劑、表面活性劑、離子螯合劑等高附加值產(chǎn)品。如果生物基丁二酸的生產(chǎn)成本能降到可接受的范圍內(nèi)，相信未來作為平臺(tái)化合物的丁二酸產(chǎn)品市場(chǎng)將大幅度增長(zhǎng)。

表1 已建成的生物基丁二酸生產(chǎn)線Table 1 Status of industrial production of succinic acid

2 生產(chǎn)菌株

生產(chǎn)菌株決定了發(fā)酵產(chǎn)量、得率及生產(chǎn)強(qiáng)度，這三個(gè)是決定生物轉(zhuǎn)化經(jīng)濟(jì)性的參數(shù)。同時(shí)，生產(chǎn)菌株也決定了配套的發(fā)酵及下游分離工藝，從而決定了生物基丁二酸的總體生產(chǎn)成本。近二十年來，研究者們?cè)诙《嵘a(chǎn)菌株的選育和代謝工程改造方面做了大量工作[20]。從菌種來源及改造方式上可將這些生產(chǎn)菌株分為三類，天然產(chǎn)丁二酸菌株：產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes）、產(chǎn)琥 珀 酸 厭 氧 螺 菌 （Anaerobiospirillum succiniciproducens）、產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌（Mannheimia succiniciproducens）；原核類基因工程菌株：大腸桿菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）；真核類基因工程菌株：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）。表2列出了具備工業(yè)價(jià)值的丁二酸生產(chǎn)菌株。本節(jié)將選擇這三類菌株中較具代表性的三種菌株：大腸桿菌（E. coli）、產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（A.succinogenes）以及解脂耶氏酵母（Y.lipolytica），分別介紹這三種菌株各自的特點(diǎn)，及采用的代謝工程改造策略或菌種選育方法。

2.1 大腸桿菌

代謝工程發(fā)展30年來，研究者們?cè)诶么x工程策略改造模式微生物生產(chǎn)有機(jī)酸方面做了大量工作。大腸桿菌（E. coli）由于遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、培養(yǎng)基要求簡(jiǎn)單和生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn),被廣泛用于研究以獲得高產(chǎn)丁二酸的基因工程菌株[32]。大腸桿菌合成丁二酸的代謝途徑見圖1。為了使代謝流流向丁二酸，研究者利用到的代謝工程策略包括加強(qiáng)丁二酸生成途徑并消除副產(chǎn)物積累、增加底物轉(zhuǎn)運(yùn)、優(yōu)化輔因子代謝等方法。

表2 高產(chǎn)丁二酸的生產(chǎn)菌株Table 2 Production strain of succinic acid

2.1.1 調(diào)控丁二酸代謝路徑中的關(guān)鍵酶 為了使代謝流流向TCA 循環(huán)還原支路以生成丁二酸，可以過表達(dá)幾種關(guān)鍵的羧化酶。其中，PEP 羧化酶（PPC）和PEP 羧化激酶（PCK）是催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）轉(zhuǎn)化為草酰乙酸（OOA）反應(yīng)的關(guān)鍵酶[33-34]。PCK 在大腸桿菌中主要參與的是糖異生途徑，但它卻是產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中參與PEP 羧化反應(yīng)的關(guān)鍵酶。PCK在參與羧化時(shí)能比PPC多生成一分子ATP，因此從能量守恒層面PCK 更有利于菌株生成丁二酸[35]。Singh 等[36]結(jié)合熱力學(xué)代謝流平衡分析(TFBA)，在E. coliAD32 (ΔldhA, ΔpflB, ΔptsG)中過表達(dá)PEP 羧化激酶基因（pck），發(fā)現(xiàn)能同時(shí)提高菌體生長(zhǎng)速率和丁二酸的產(chǎn)量及得率。Zhang 等[37]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌KJ073參與丁二酸生成的四種羧化酶基因（ppc,maeA,maeB,pck）中，pck基因的缺失對(duì)菌株的生長(zhǎng)、糖代謝、丁二酸產(chǎn)量及產(chǎn)率影響最為明顯。進(jìn)一步，他們?cè)趐pc基因缺失的菌株中加強(qiáng)pck基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PCK 能代替PPC 的羧化活性，并能提高菌株在厭氧條件下的丁二酸生產(chǎn)能力。

另外，引入外源基因構(gòu)建新的羧化途徑使代謝流流向丁二酸生成方向，也能明顯提高丁二酸的產(chǎn)量。丙酮酸羧化酶（PYC）能將丙酮酸（pruvate）羧化為草酰乙酸(OOA)，在大腸桿菌中引入外源丙酮酸羧化酶基因（pyc），有助于丁二酸生成并降低副產(chǎn)物產(chǎn)生[38]。Vemuri 等[39]在兩株重組大腸桿菌NZN111(Δldh,Δpfl) 和AFP111(Δldh,Δpfl,ΔptsG) 中 表 達(dá)Rhizobium etli的丙酮酸羧化酶基因(pyc)，該方法消除了菌株中丙酮酸積累并激活了乙醛酸途徑，使菌株的丁二酸產(chǎn)量以及細(xì)胞生長(zhǎng)速率和底物轉(zhuǎn)化率都明顯增高。Okino 等[40]在C.glutamicum(ΔldhA)中過表達(dá)pyc基因，也獲得了丁二酸產(chǎn)量和生產(chǎn)速率高達(dá)146g/L和3.2 g/(L·h)的菌株。

圖1 大腸桿菌合成丁二酸的代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of synthesis of succinic acid by Escherichia coli

2.1.2 優(yōu)化工程菌株內(nèi)的輔因子 在厭氧條件下，通過TCA 循環(huán)還原支路合成丁二酸的主要障礙是NADH 的限制。要提高丁二酸的轉(zhuǎn)化率，一方面要增加NADH 的生成量，另一方面要提高NADH 的利用率。Wang 等[41]利用數(shù)學(xué)及計(jì)算機(jī)建模從基因組層面分析大腸桿菌的代謝模型，認(rèn)為激活乙醛酸途徑——通過該途徑生成1 mol 丁二酸僅消耗1.25 mol NADH，能提高NADH 的利用率以增加菌株丁二酸產(chǎn)量。Sánchez 等[42]在敲除了大腸桿菌MG1655菌株中乙醇脫氫酶基因(adhE)、乳酸脫氫酶基因(ldh)、乙酸磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和乙酸激酶基因(ptaack)這些競(jìng)爭(zhēng)性副產(chǎn)物生成途徑上的關(guān)鍵酶基因后，進(jìn)一步敲除aceBAK操縱子阻遏物的基因(iclR)以激活大腸桿菌中的乙醛酸途徑，得到的大腸桿菌SBS550MG 丁二酸得率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別為1.1 g/g 和1.18 g/(L·h)。Balzer 等[43]將C.boidinii的NAD+依賴型甲酸脫氫酶基因fdh1轉(zhuǎn)入大腸桿菌SBS550MG中，減少了菌株中副產(chǎn)物甲酸積累并提供額外的還原力，使菌株的丁二酸生產(chǎn)速率從1.4 g/(L?h)提高到2.0 g/(L ?h)。Litsanov 等[30]在C. glutamicum(Δcat,Δpqo, Δpta-ack)過表達(dá)三磷酸甘油醛脫氫酶基因（gapA）的同時(shí)，將M.vaccae的fdh基因整合進(jìn)基因組中進(jìn)行弱表達(dá)，降低了菌株的副產(chǎn)物生成，并使丁二酸得率提升到了1.06 g/g。

NAD(P)H 和NAD(P)+的平衡對(duì)于丁二酸生產(chǎn)同樣重要。大腸桿菌NZN111(Δldh,Δpfl)具備潛在的丁二酸生產(chǎn)能力,但由于NADH 依賴的乳酸脫氫酶(LDH)的失活造成了菌株NAD+/NADH 比例失衡，使其在厭氧條件下幾乎喪失了葡萄糖代謝能力[44]。梁麗亞等[45]構(gòu)建了重組大腸桿菌NZN111/pTrc99amdh ，在厭氧發(fā)酵過程中通過添加IPTG 誘導(dǎo)蘋果酸脫氫酶(MDH)表達(dá)，使得菌株中NADH/NAD+比例從0.64 下降到0.26，讓該菌株在厭氧條件下重新具備了生長(zhǎng)及代謝葡萄糖的能力。

2.1.3 消除競(jìng)爭(zhēng)途徑 消除競(jìng)爭(zhēng)途徑理論上確實(shí)能增加丁二酸合成，但失活競(jìng)爭(zhēng)途徑的關(guān)鍵基因，往往也會(huì)使菌體的生長(zhǎng)和代謝受到影響[46]。微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，恢復(fù)生長(zhǎng)速度往往涉及到多步代謝反應(yīng)，通過改造特定的基因位點(diǎn)很難使菌株重新具有原來的生長(zhǎng)速度。因此將敲除特定基因的菌株進(jìn)行代謝進(jìn)化(metabolic evolution)，經(jīng)過多次傳代進(jìn)化選育出生長(zhǎng)速度快的菌株是一種有效的改造策略。Jantama 等[47]利用途徑理性設(shè)計(jì)和代謝進(jìn)化組合的策略構(gòu)建出了大腸桿菌KJ060 (ΔldhA,ΔadhE,ΔackA,ΔfocA,ΔpflB) 和 KJ073 (ΔldhA,ΔadhE,ΔackA,ΔfocA,ΔpflB,ΔmgsA,ΔpoxB)，能夠以增加剩余酶的代謝通量方式維持菌體內(nèi)氧化還原平衡、ATP供給和正常生長(zhǎng)，菌株的丁二酸生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到了70～80 g/L。為降低副產(chǎn)物生成，Jantama等[48]對(duì)KJ073 的代謝途徑進(jìn)一步進(jìn)行了理性改造，最終得到的菌株KJ122 在厭氧條件下96 h 內(nèi)生產(chǎn)83 g/L左右的丁二酸,得率達(dá)到0.9 g/g。

2.2 產(chǎn)琥珀酸放線桿菌

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(A.succinogenes)是從牛瘤胃中分離出的一種革蘭陰性菌。它是一株兼性厭氧菌，并具有較高的底物耐受性。野生型產(chǎn)琥珀酸放線桿菌在通入CO2的厭氧條件下能將葡萄糖高效轉(zhuǎn)化為丁二酸，密歇根生物技術(shù)研究所（MBI）早在1981 年就將該菌株用作丁二酸生產(chǎn)菌株[49]。McKinlay 等[50]對(duì)A. succinogenes進(jìn)行全基因組測(cè)序并分析其代謝途徑，發(fā)現(xiàn)它擁有利用20種不同碳源的能力，并且A. succinogenes缺乏完整的TCA 循環(huán)以及乙醛酸途徑，它唯一的丁二酸合成途徑是通過羧化PEP形成OOA后經(jīng)TCA 還原支路生成丁二酸。他們還發(fā)現(xiàn)該菌株整體的電子供應(yīng)及還原力生成都明顯偏向利于丁二酸合成的方向。雖然對(duì)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌代謝途徑的認(rèn)知逐漸清晰，但因?yàn)槿狈Τ墒斓幕虿僮鞴ぞ撸N的選育手段仍以誘變技術(shù)、代謝控制育種、適應(yīng)性進(jìn)化等半理性育種方法為主。Zheng 等[51]利用基因組重排技術(shù)對(duì)A.succinogenes進(jìn)行了菌種改造，出發(fā)菌株經(jīng)過三輪基因重排后，篩選出的菌株F3-II-3-F 搖瓶產(chǎn)量比出發(fā)菌株增加73%，該菌株經(jīng)過48 h 補(bǔ)料發(fā)酵能產(chǎn)生95.6 g/L 丁二酸，生產(chǎn)速率為1.99 g/(L·h)，并且副產(chǎn)物生成明顯減少。經(jīng)改造后的A.succinogenes雖然具備了作為生產(chǎn)菌株的潛力，但由于其大量維生素和氨基酸的合成途徑的缺失，造成了它基本培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分復(fù)雜，一定程度上影響了將其用作生產(chǎn)菌株的經(jīng)濟(jì)性[52]。

2.3 解脂耶氏酵母

相較于細(xì)菌生產(chǎn)菌株，酵母具有耐高酸和高滲透壓的特點(diǎn)。酵母作為生產(chǎn)菌株最大的優(yōu)勢(shì)在于能在低pH 條件下進(jìn)行發(fā)酵。如若發(fā)酵過程中不加入pH 調(diào)節(jié)劑，將有效減少發(fā)酵過程中無機(jī)鹽的產(chǎn)生，以節(jié)省下游工藝中分離純化步驟，降低丁二酸下游分離成本。低pH 發(fā)酵策略在Cargill 公司生產(chǎn)D-乳酸的實(shí)踐過程中得到了很好的應(yīng)用。雖然Reverdia 聲稱他們能用釀酒酵母在pH 3.0 條件下發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸達(dá)到100 g/L的產(chǎn)量，但并沒有明確的信息表明他們這株生產(chǎn)菌株的來源和改造方法[53]。

由于釀酒酵母（S.cerevisiae）是最早被報(bào)道出的能通過低pH 發(fā)酵高產(chǎn)丁二酸的菌株，研究者早期的興趣主要集中在釀酒酵母代謝改造上。與細(xì)菌類生產(chǎn)菌株不同，釀酒酵母的TCA 循環(huán)還原支路代謝能力十分弱，丁二酸也并不是釀酒酵母的代謝終端產(chǎn)物。代謝工程用于構(gòu)建產(chǎn)丁二酸釀酒酵母的策略，一種是針對(duì)TCA 循環(huán)氧化支路和乙醛酸循環(huán)這兩條途徑的改造[54]。Raab 等[55]敲除釀酒酵母AH22ura3 的NADP+依賴型異檸檬酸脫氫酶基因(idh1)、NAD+依賴型異檸檬酸脫氫酶基因(idp1)以中斷TCA 循環(huán)氧化支路中異檸檬酸到α-酮戊二酸的途徑，使代謝流流向乙醛酸循環(huán)通過還原支路生成丁二酸，同時(shí)他們敲除琥珀酸脫氫酶基因sdh1、sdh2，阻斷延胡索酸生成以增強(qiáng)丁二酸積累。改造后的菌株菌體生長(zhǎng)并沒有受到明顯抑制，在搖瓶培養(yǎng)中產(chǎn)生了3.62 g/L 丁二酸。還有一種改造策略是在丙酮酸脫羧酶缺陷型釀酒酵母中，重新構(gòu)建一條完整的TCA 循環(huán)還原支路，使酵母在通入CO2的厭氧條件下生產(chǎn)丁二酸。Yan 等[56]敲除釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶基因（pdc）及延胡索酸酶基因(fum1)增加中間產(chǎn)物丙酮酸和延胡索酸積累，再通過過表達(dá)丙酮酸羧化酶基因(pyc2)、蘋果酸脫氫酶基因(mdh3r)以及來自E.coli的延胡索酸酶基因(FumC)和富馬酸還原酶基因(Frd S1)，構(gòu)建起一條還原途徑合成丁二酸，pH 3.8環(huán)境中該菌株產(chǎn)13 g/L丁二酸。

近年，學(xué)者們開始嘗試將解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）改造成為丁二酸生產(chǎn)菌株，所獲得的菌株生產(chǎn)能力不但明顯強(qiáng)于釀酒酵母，且最高產(chǎn)量已超過了細(xì)菌類生產(chǎn)菌株[57]。解脂耶氏酵母是一種半子囊酵母，主要集中在富含脂質(zhì)的環(huán)境中，能利用多種疏水性底物生長(zhǎng)，由于其能夠在胞內(nèi)積累大量油脂，許多研究者選擇解脂耶氏酵母用于脂質(zhì)積累調(diào)控機(jī)理的研究[58]。而最近研究表明，它還具有生產(chǎn)檸檬酸、α-酮戊二酸及甘露醇等高附加值化合物的能力[59-60]。相比釀酒酵母，解脂耶氏酵母屬于嚴(yán)格好氧型微生物，它需要完整的TCA 循環(huán)以維持生長(zhǎng)[61]。也就是說，理論上失活解脂耶氏酵母的琥珀酸脫氫酶(SDH)將破壞其TCA 循環(huán)完整性，使菌株為致死表型。Yuzbashev 等[62]利用新的策略得到了缺失sdh2基因的解脂耶氏酵母突變株Y-3312，該菌株能在甘油上生長(zhǎng)并生產(chǎn)丁二酸，在CaCO3緩沖液的搖瓶培養(yǎng)中該菌株丁二酸產(chǎn)量能達(dá)到45 g/L，在沒有緩沖體系的搖瓶中也能產(chǎn)17 g/L 丁二酸。Gao等[22]通過失活解脂耶氏酵母Po1f 中編碼亞基SDH5的基因Ylsdh5得到突變菌株P(guān)GC01003，該菌株能以粗甘油為底物產(chǎn)丁二酸，并具備在葡萄糖培養(yǎng)基中弱生長(zhǎng)的能力，該菌株在搖瓶中發(fā)酵產(chǎn)43 g/L 丁二酸，在2.5 L 發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵丁二酸產(chǎn)量達(dá)160.2 g/L。為進(jìn)一步降低副產(chǎn)物乙酸生成并提高低pH 發(fā)酵能力，Cui 等[63]敲除Y. lipolytica中編碼乙酰CoA 水解酶的基因Ylach，并過表達(dá)來自釀酒酵母的PEP 羧基酶基因（Scpck）和琥珀酰CoA合成酶的beta亞基基因（Ylscs2）以加強(qiáng)丙酮酸羧化和TCA 氧化支路代謝通量，得到的菌株P(guān)GC202 丁二酸產(chǎn)量在出發(fā)菌株基礎(chǔ)上提高了4.3 倍，該菌株能在自然pH 條件下通過補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)110.7 g/L 丁二酸，產(chǎn)物得率為0.53 g/g。

3 生物過程優(yōu)化

3.1 低值生物質(zhì)利用

為降低原料成本，研究者們嘗試將農(nóng)林廢棄物、餐飲有機(jī)廢棄物、工業(yè)過程副產(chǎn)物等低值生物質(zhì)用作生產(chǎn)丁二酸的發(fā)酵原料。這些低值生物質(zhì)原料不但價(jià)格低廉，如甘油、山梨糖醇等碳源還能為發(fā)酵提供額外的還原力[64]。Zheng 等[65]比較了A.succinogenesCGMCC1593 在四種秸稈水解液中產(chǎn)丁二酸的能力，發(fā)現(xiàn)菌株利用玉米秸稈水解液發(fā)酵時(shí)丁二酸生產(chǎn)能力最強(qiáng)，經(jīng)過44 h 補(bǔ)料發(fā)酵丁二酸產(chǎn)量達(dá)到53.2 g/L，轉(zhuǎn)化率82.5%，產(chǎn)率1.21 g/(L·h)。Zhang 等[66]開發(fā)了一種完全利用過期面包作丁二酸發(fā)酵原料的生產(chǎn)工藝，他們先用A. awamori和A.oryzae混合孢子液把面包通過固態(tài)發(fā)酵方式水解，再利用A.succinogenes對(duì)水解液進(jìn)行厭氧發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后丁二酸產(chǎn)量達(dá)到31.7 g/L，經(jīng)離子交換柱處理后進(jìn)行減壓蒸餾結(jié)晶，能夠回收到純度達(dá)96%～97.7%丁二酸晶體。Li等[23]利用富含葡萄糖的廚余垃圾水解液作碳源，在不添加pH 調(diào)節(jié)劑的條件下使用Y. lipolyticaPGC202 通過流加補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)得71.6 g/L 丁二酸，產(chǎn)物得率為0.61 g/g。而過去幾年來生物柴油產(chǎn)量增加，其生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物——粗甘油也成為一種潛在的低值生物質(zhì)原料[67]，Gao等[22]就是將粗甘油用作碳源，使解脂耶氏酵母PGC01003發(fā)酵得到了160 g/L丁二酸。

3.2 發(fā)酵過程控制

發(fā)酵策略對(duì)實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化過程中高產(chǎn)量、高轉(zhuǎn)化率和高生產(chǎn)效率有明顯影響。由于底物濃度可能影響細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，流加補(bǔ)料是常見的丁二酸發(fā)酵策略[68]。高產(chǎn)丁二酸菌株合成途徑的差別，造成了丁二酸生產(chǎn)中用到了三種不同的供氧策略：解脂耶氏酵母和重組大腸桿菌HL27659k[69]能在有氧條件下高產(chǎn)丁二酸；產(chǎn)琥珀酸放線桿菌和多數(shù)大腸桿菌都利用厭氧或雙階段發(fā)酵策略生產(chǎn)丁二酸。Vemuri等[70]的研究表明使用兩階段發(fā)酵策略時(shí)，有氧階段能夠激活重組大腸桿菌的乙醛酸途徑，菌株AFP111(pTrc99A-pyc)在最佳的供氧及轉(zhuǎn)厭氧條件下最終丁二酸產(chǎn)量達(dá)到99.2 g/L，生產(chǎn)速率1.3 g/(L·h)，得率1.1 g/g。而Wang等[71]利用在線控制溶氧方法，通過補(bǔ)料發(fā)酵使大腸桿菌SD121 在有氧階段OD 值達(dá)到50，轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵后該菌株丁二酸產(chǎn)量能到達(dá)116.2 g/L，整個(gè)生物轉(zhuǎn)化過程丁二酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到1.13 g/g,生產(chǎn)速率高達(dá)1.55 g/ (L·h)。此外，纖維床反應(yīng)器[72]、膜生物反應(yīng)器[73]也被用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的丁二酸生產(chǎn)，但是這些發(fā)酵裝置昂貴的投資和維護(hù)成本，以及使用過程中更高的故障和污菌風(fēng)險(xiǎn)，都限制了這些裝置在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[74]。

3.3 CO2供給形式及pH調(diào)節(jié)劑

細(xì)菌類生產(chǎn)菌株進(jìn)行厭氧發(fā)酵合成丁二酸時(shí)，通常會(huì)通入CO2氣體，這一方面能為OAA 轉(zhuǎn)化為PEP 提供所需CO2，另一方面也能維持發(fā)酵液環(huán)境處于厭氧。因?yàn)轸然笇?duì)CO2親和力較低，通常需要相當(dāng)高濃度（分壓）的CO2氣體來驅(qū)動(dòng)代謝流進(jìn)入TCA 還原支路[75]。Lu 等[76]研究發(fā)現(xiàn)CO2氣體濃度在0～50%區(qū)間時(shí)，丁二酸產(chǎn)量隨CO2氣體濃度增加呈明顯上升趨勢(shì)，但當(dāng)濃度高于50%后丁二酸產(chǎn)量增加不明顯。此外，溶解CO2濃度還可以通過添加碳酸鹽實(shí)現(xiàn)，而碳酸鹽也能起到維持發(fā)酵液中pH 的作用。

pH 通常是發(fā)酵過程中的關(guān)鍵控制參數(shù)，大多數(shù)細(xì)菌菌株需要接近中性pH 環(huán)境才能獲得最佳的發(fā)酵性能。丁二酸發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量有機(jī)酸，因此必須添加pH 調(diào)節(jié)劑使發(fā)酵環(huán)境保持中性。Andersson 等[77]研究了pH 調(diào)節(jié)劑（Na2CO3、NaOH、K2CO3、KOH 和NH3·H2O）以及滲透壓對(duì)大腸桿菌AFP184 發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的影響。使用Na2CO3時(shí)菌株能得到最高產(chǎn)量77 g/L，使用NH3·H2O 時(shí)菌體生長(zhǎng)受到明顯抑制，產(chǎn)量到40 g/L 時(shí)菌體生長(zhǎng)就完全停止。Li 等[78]的研究表明，MgCO3、Na2CO3、NaHCO3、Mg(OH)2、Ca(OH)2、CaCO3、NaOH 和NH3·H2O 這8 種pH 調(diào)節(jié)劑中，固體MgCO3最利于A. succinogenesNJ113 細(xì)胞生長(zhǎng)、底物利用及丁二酸生產(chǎn)，Ca(OH)2、CaCO3和NH3·H2O 用作pH 調(diào)節(jié)劑時(shí)會(huì)導(dǎo)致丁二酸產(chǎn)量降低。同時(shí)他們發(fā)現(xiàn)使用Mg(OH)2和NaOH 混合堿液能達(dá)到與固體MgCO3相同效果，這是因?yàn)榛旌蠅A液中也含有能增加PCK 酶活的鎂離子，以使菌體代謝旺盛提高丁二酸產(chǎn)量。這里需要指出，雖然固體碳酸鎂被認(rèn)為是最有利于丁二酸發(fā)酵的碳酸鹽，但在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中如何保證在添加這種固體鹽時(shí)不染菌，仍是亟待解決的問題。

3.4 低pH發(fā)酵工藝

發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸的一個(gè)趨勢(shì)是開發(fā)低pH 發(fā)酵技術(shù)，避免發(fā)酵過程中因添加堿液而形成無機(jī)鹽。這是因?yàn)樘幚磉@些無機(jī)鹽會(huì)增加下游單元操作中的投資成本和產(chǎn)量損失[79]。低pH 發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的工藝最早是在DSM 申請(qǐng)的專利中被提及，DSM的生產(chǎn)菌株是一株釀酒酵母。而有跡象表明，原先使用大腸桿菌的Bioamber 公司可能從嘉吉公司得到了一株酵母生產(chǎn)菌株C. krusei用于丁二酸低pH生產(chǎn)[80]。迄今為止，全球公開報(bào)道的低pH 發(fā)酵工藝下最高丁二酸產(chǎn)量的生產(chǎn)菌株，是由Li 等[63]通過代謝改造得到的一株解脂耶氏酵母，該菌株能在完全不添加pH 調(diào)節(jié)劑的情況下通過補(bǔ)加甘油有氧發(fā)酵產(chǎn)生110.7 g/L丁二酸。

4 分離過程

與石化法相比，生物法生產(chǎn)丁二酸的明顯劣勢(shì)在于，丁二酸發(fā)酵液中產(chǎn)物濃度低且成分復(fù)雜，造成產(chǎn)物分離困難，而下游分離的成本占丁二酸生產(chǎn)總成本的50%～70%[79]。丁二酸發(fā)酵液中的雜質(zhì)主要包括菌體、發(fā)酵液中殘留糖分、無機(jī)鹽以及發(fā)酵副產(chǎn)物。生物基丁二酸的分離工藝很大程度上取決于發(fā)酵液中大量存在的無機(jī)鹽，細(xì)菌菌株的發(fā)酵液中多數(shù)無機(jī)鹽為發(fā)酵過程中添加堿液產(chǎn)生，對(duì)無機(jī)鹽的去除及回收工藝顯著影響著丁二酸的生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性。依據(jù)不同無機(jī)鹽的分離方法差異，分離工藝主要分為直接結(jié)晶法、電滲析法、鈣鹽法、氨沉淀法、鎂鹽分離法（圖2）。需要指出的是，本節(jié)介紹的是從發(fā)酵液中分離丁二酸的工藝。如要獲得更高純度（＞99%）的聚合物單體，還需進(jìn)一步純化回收到的丁二酸晶體。

4.1 鈣鹽法

圖2 丁二酸分離工藝流程圖Fig.2 Process flow chart of succinic acid separation

鈣鹽法是傳統(tǒng)的丁二酸分離方法，這一方法在乳酸及檸檬酸工業(yè)中已有了成熟的應(yīng)用[81]。通過添加Ca(OH)2中和發(fā)酵液得到琥珀酸鈣沉淀，過濾回收這些琥珀酸鈣沉淀后，再加入硫酸從沉淀中釋放出游離的琥珀酸，然后將游離的琥珀酸經(jīng)進(jìn)一步純化就能得到高純度的丁二酸[82]。雖然該方法有成熟的商業(yè)應(yīng)用，但這一方法也存在著明顯的缺點(diǎn)：一是產(chǎn)品收率低；二是沉淀過程中氫氧化鈣和硫酸用量較大，且這些試劑不能重復(fù)使用；三是分離過程中會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)物硫酸鈣沉淀，而這種副產(chǎn)物無法得到有效利用，并因此增加額外的成本。

4.2 氨沉淀法

在發(fā)酵過程中，使用氨水作為pH 調(diào)節(jié)劑時(shí)，會(huì)形成發(fā)酵產(chǎn)物琥珀酸銨，這時(shí)采用氨沉淀法分離發(fā)酵液中的丁二酸。通過離心將發(fā)酵液中細(xì)胞分離出后，將發(fā)酵液與硫酸或pH 1.5～1.8 的硫酸氫銨溶液混合，使游離氨基琥珀酸形成琥珀酸沉淀和硫酸銨鹽，琥珀酸沉淀可溶解于甲醇中并通過重結(jié)晶將琥珀酸分離純化，而副產(chǎn)物硫酸銨溶液可熱裂解為氨和硫酸氫銨。這種分離方式的優(yōu)點(diǎn)在于廢棄副產(chǎn)物產(chǎn)生量較少，且可回收利用堿液，缺點(diǎn)在于氨對(duì)丁二酸發(fā)酵過程會(huì)起抑制作用[77]，且熱裂解硫酸銨過程中耗能較大，產(chǎn)生的副產(chǎn)物硫酸氫銨并不能作為堿液回用。

4.3 鎂鹽分離法

當(dāng)使用氫氧化鎂作pH 調(diào)節(jié)劑時(shí)，選用鎂鹽分離法從發(fā)酵液中分離丁二酸。發(fā)酵液在分離出細(xì)胞后，液體中琥珀酸鎂在鹽酸作用下轉(zhuǎn)化為琥珀酸（未解離）和氯化鎂。可以通過直接結(jié)晶的方法將琥珀酸沉淀，并把沉淀和氯化鎂分離。而氯化鎂通過熱裂解可以得到氧化鎂和鹽酸。這一分離方法優(yōu)勢(shì)在于丁二酸發(fā)酵及分離過程中產(chǎn)生的無機(jī)鹽都能得到重復(fù)利用。但需要注意的是氯化鎂的熱裂解成本較高，而回收后所得的堿液純度會(huì)有影響。

4.4 電滲析法

利用氫氧化鈉作為pH 調(diào)節(jié)劑時(shí)，采用電滲析法分離發(fā)酵液中的丁二酸。除去菌體的發(fā)酵液須通過離子交換柱后再利用雙膜電滲析工藝將琥珀酸和氫氧化鈉分離，并將氫氧化鈉回用[83]。雖然電滲析的方法有較為成熟的商業(yè)應(yīng)用，但考慮到前期設(shè)備的成本投入，還有電滲析膜使用過程中的維護(hù)成本，這一方案的使用費(fèi)用也是所有分離方法里最高的[84]。

4.5 直接結(jié)晶法

低pH 發(fā)酵結(jié)合直接結(jié)晶工藝生產(chǎn)丁二酸被認(rèn)為是較具潛力的丁二酸生產(chǎn)方案。如果發(fā)酵過程中只少量產(chǎn)生無機(jī)鹽，將發(fā)酵液通過直接結(jié)晶的方法從中提取丁二酸，將大幅節(jié)省分離流程并降低丁二酸分離成本。Luque 等[85]發(fā)現(xiàn)利用真空蒸餾法可以有效分離低pH 發(fā)酵液中的甲酸、乙酸等發(fā)酵副產(chǎn)物。Li 等[86]的研究表明在4℃、pH 2.0 條件下，從產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵液中能直接分離出90%純度的丁二酸晶體，產(chǎn)品收率為70%。盡管低pH發(fā)酵存在生產(chǎn)速率和得率較低的缺點(diǎn)，但該方案具備有效節(jié)省下游單元操作中投資和生產(chǎn)成本的優(yōu)勢(shì)。

5 結(jié) 語(yǔ)

一直以來研究人員和生物技術(shù)公司都希望能得到經(jīng)濟(jì)可行的生物基丁二酸生產(chǎn)方案。要使丁二酸成為“生物基平臺(tái)化學(xué)品”的目標(biāo)真正實(shí)現(xiàn)，需要在現(xiàn)有生產(chǎn)工藝基礎(chǔ)上進(jìn)一步降低丁二酸的生產(chǎn)成本。研究人員在改造生產(chǎn)菌株提升丁二酸生產(chǎn)效率的同時(shí)，需要同時(shí)考慮與菌株配套的整體發(fā)酵及分離工藝的經(jīng)濟(jì)性。要使工業(yè)化水平生物基丁二酸具備更好的市場(chǎng)前景，還可以從以下方面進(jìn)行優(yōu)化：(1)利用代謝工程策略進(jìn)一步優(yōu)化菌株代謝途徑，提高產(chǎn)物生產(chǎn)能力的同時(shí)降低副產(chǎn)物生成，降低產(chǎn)物分離過程難度；(2)選擇價(jià)格低廉、質(zhì)量穩(wěn)定并有利于菌株生長(zhǎng)及下游分離的發(fā)酵原料，降低發(fā)酵生產(chǎn)的整體成本；(3)優(yōu)化下游分離工藝，盡可能簡(jiǎn)化分離純化過程以降低分離成本，并提高丁二酸回收率及純度。

總之，隨著石油資源日漸枯竭，未來石油化工產(chǎn)品的價(jià)格必將逐年上漲，丁二酸作為生物基化學(xué)品產(chǎn)業(yè)鏈中重要的節(jié)點(diǎn)物質(zhì)，如果研究人員們能探索出價(jià)格更低廉的生產(chǎn)方案，使生物基丁二酸應(yīng)用從高附加值產(chǎn)品領(lǐng)域轉(zhuǎn)向大宗化學(xué)品領(lǐng)域，必將為生物基化學(xué)品領(lǐng)域注入新的發(fā)展動(dòng)力。