PCSK9拮抗劑干預(yù)心梗大鼠心肌細(xì)胞凋亡及炎癥因子表達(dá)的機(jī)制研究

馮 華，代 濤，陳 鐵，譚力力，潘 淼，孫 穎，張秀春

（沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，遼寧 沈陽 110035）

細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的主要發(fā)病環(huán)節(jié)之一，而細(xì)胞凋亡的多少與缺血再灌注損傷程度存在一定聯(lián)系[1]。人類前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（PCSK9）是生物信息方法與DNA微陣列技術(shù)中，發(fā)現(xiàn)的新的血液膽固醇代謝相關(guān)的基因。而目前有研究指出，PCSK9在膽固醇代謝中起到較為重要的作用，并參與細(xì)胞凋亡[2]。但PCSK9在心肌缺血再灌注中，是否存在表達(dá)，與心肌缺血之間是否存在聯(lián)系，研究較少[3]。本文通過將心梗大鼠進(jìn)行研究，觀察PCSK9拮抗劑對心肌細(xì)胞凋亡與炎癥抑制的表達(dá)意義，內(nèi)容如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年9月～2018年9月我院培養(yǎng)的12例大鼠，其中對照組4例，缺血再灌注6 h、12 h各4例。

1.2 方法

均為健康雄性大鼠，按照清潔級動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)的原則進(jìn)行分組。其中對照組為假手術(shù)組，只穿線不結(jié)扎，觀察6 h。所有大鼠均自由飲水。

使用10%水合氯醛麻醉腹腔注射大鼠，并進(jìn)行頸部氣管插管，使用動(dòng)物人工呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械輔助呼吸，在胸骨左側(cè)1 cm做一縱向切口，打開胸腔，在左心耳根部下方2 mm處進(jìn)針動(dòng)脈圓錐旁出針，放松活結(jié)即可恢復(fù)血流形成再灌注。實(shí)驗(yàn)中觀察心電圖，出現(xiàn)ST段提高或深Q波形成并結(jié)扎線以下左心室壁，顏色變灰白，表明模型制備成功，結(jié)扎45 min后開放阻斷鉗，并仔細(xì)縫合切口，將腹腔內(nèi)剩余氣體抽盡，并觀察大鼠自主呼吸情況，仔細(xì)縫合氣管切口。手術(shù)結(jié)束后肌肉注射青霉素，積極預(yù)防感染，并適當(dāng)保暖，喂養(yǎng)生理鹽水。對照組僅開胸穿線，但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)嗎，需要收集血液及缺血區(qū)心肌組織，心肌組織使用PBS漂洗，立即置液氮中冷凍保存，血液于室溫靜置2 h，3000 rpm離心20 min后吸取上層血清，于-20℃保存。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察缺血/再灌注大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡情況。

采用ELISA 法檢測C 反應(yīng)蛋白（CRP）、白細(xì)胞介素6（IL-6）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）炎癥因子情況[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

均采取SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對本文數(shù)據(jù)進(jìn)行分析計(jì)算，在計(jì)算計(jì)數(shù)資料的時(shí)候采取x2，選擇n（%）進(jìn)行表達(dá)，計(jì)算計(jì)量數(shù)據(jù)的時(shí)候采取t，選擇（±s）表達(dá)，其中當(dāng)P＜0.05的時(shí)候，數(shù)據(jù)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)。

2 結(jié) 果

2.1 缺血/再灌注大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡情況

使用DNA試劑盒提取各試驗(yàn)組大鼠心肌中的DNA，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中再灌注6 h、12 h出現(xiàn)凋亡細(xì)胞所特有的DNA圖譜，且灌注時(shí)間越長，梯狀條帶越明顯，提示細(xì)胞凋亡程度加重。

2.2 不同大鼠之間炎癥表達(dá)情況

缺血再灌注12 h組在各項(xiàng)炎癥情況上均高于對照組、缺血再灌注6 h，差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同大鼠之間炎癥表達(dá)情況[n=4，（±s）]

表1 不同大鼠之間炎癥表達(dá)情況[n=4，（±s）]

組別 CRP（mg/L） IL-6（ng/L）TNF-α（ng/L）對照組 2.54±0.54 54.52±10.52 60.41±10.25缺血再灌注6 h 4.54±0.85 156.68±15.42 215.69±12.85缺血再灌注12 h 7.34±2.11 342.22±35.34 534.45±62.44 F 12.760 159.800 168.120 P 0.002 0.000 0.000

3 討 論

目前我國心血管疾病發(fā)病率與死亡率逐年出現(xiàn)上升趨勢，而缺血性心臟病主要是由于多種原因?qū)е碌墓诿}血流量不足，難以滿足心肌對能量所導(dǎo)致的心肌損害。目前主要采取冠脈搭橋或溶栓治療，能夠改善患者心肌血流供應(yīng)，并保護(hù)缺血心肌，但術(shù)后并發(fā)癥較多，使得效果并不理想[5]。而心肌缺血再灌注是多種作用下的病理作用，其作用機(jī)制目前并不清楚，但需要進(jìn)一步明確心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制，為臨床治療提供新理論。

本文通過將PCSK9拮抗劑進(jìn)行研究，選擇不同情況的大鼠，結(jié)果中：再灌注6 h、12 h出現(xiàn)凋亡細(xì)胞所特有的DNA圖譜，且灌注時(shí)間越長，梯狀條帶越明顯，提示細(xì)胞凋亡程度加重[6]。缺血再灌注12 h組在各項(xiàng)炎癥情況上均高于對照組、缺血再灌注6 h，差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞凋亡與心肌缺血再灌注損傷之間存在較為明顯的關(guān)系，心肌缺血再灌注，且本文結(jié)果中再灌注時(shí)間越長的大鼠，且細(xì)胞凋亡情況越嚴(yán)重[7]。且有研究在人類心肌梗死的尸檢中，也發(fā)現(xiàn)了急性心肌梗死的心肌細(xì)胞中存在明顯的細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)缺血再灌注損傷。其凋亡細(xì)胞主要分布在梗死灶收縮帶周圍，無梗死區(qū)域細(xì)胞其凋亡卻較少[8]。但PCSK9也已經(jīng)正式了，其能夠促進(jìn)肝LDLR的講解，增加患者冠心病與心肌梗死的患病風(fēng)險(xiǎn)；與炎癥之間也存在一定聯(lián)系，使得多項(xiàng)炎癥因子出現(xiàn)升高。

綜上所述，對于PCSK9拮抗劑干預(yù)，心梗大鼠心肌細(xì)胞凋亡較為明顯，炎癥因子將會(huì)出現(xiàn)明顯升高，且PCSK9參與了心肌缺血再灌注損傷的病理生理過程。