蛭龍活血通瘀膠囊對PD大鼠凋亡相關蛋白的影響

王 蔚，沈宏萍，楊思進，杜 淵

（西南醫科大學附屬中醫醫院，四川 瀘州 646000）

帕金森?。≒arkinson’S disease，PD）又被稱為“震顫麻痹”（Paralysis Agitans）[1]。神經細胞凋亡被證實為該病的主要病理表現，本研究通過觀察?？圃簝戎苿锡埢钛瞿z囊對PD大鼠腦組織凋亡相關蛋白Bax、caspase-3的表達，探尋該藥治療帕金森病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

清潔級健康雄性SD大鼠50只，體重180±20 g，購于成都達碩生物有限公司，普通飼料喂養，室溫22±2℃，濕度30～40%，自由攝食、飲水。按隨機數字表法分為假手術組、模型組、蛭龍活血通瘀低劑量組（ZL低劑量組）、蛭龍活血通瘀中劑量組（ZL中劑量組）、蛭龍活血通瘀高劑量組（ZL高劑量組），每組10只。

1.2 造模及給藥

模型組每日頸背部皮下注射魚藤酮溶液（溶解于二甲基亞砜、聚乙二醇-300）2 mg/kg/d，共4周[2]；假手術組僅注射二甲基亞砜及聚乙二醇-300混合溶液；ZL低、中、高劑量組分別于注射魚藤酮溶液后1周灌胃蛭龍活血通瘀膠囊（溶解于3 mL生理鹽水）0.3 g/kg/d、0.6 g/kg/d、1.2 g/kg/d；假手術組及模型組同步每日灌胃等體積的生理鹽水。

1.3 行為學觀察

大鼠給藥4周后觀察行為學改變[3]。是否拘捕行為減弱；是否毛色變臟變黃、弓背，主動活動減少；是否動作遲緩、震顫或步態不穩；是否出現單側旋轉；是否癱瘓，行走或進食困難；是否死亡等。

1.4 Bax、caspase-3蛋白表達

大鼠深度麻醉，經過0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛經心臟灌注后，剝取腦組織浸泡于4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片后再經二甲苯、梯度乙醇、蒸餾水脫蠟，熱修復后封閉，一抗及二抗孵育，漂洗后顯色，蘇木素復染，稀鹽酸分化，碳酸鋰反藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用光學顯微鏡觀察中腦黑質區相應蛋白的表達（×200），Image-Pro Plus圖像分析軟件計算Bax、caspase-3陽性細胞數作定量分析。

1.4 統計學方法

實驗數據由SPSS 13.0統計軟件分析，用均數±標準差（±s）表示。采用采用方差分析（One-way ANOVA），LSD及Dunnett法作多重比較，以P＜0.01認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組行為學比較

模型組給藥1周左右出現活動減少，進食減少，毛色光澤度下降，發黃變臟，繼續給藥后出現動作遲緩，姿勢呈弓背狀，繼而出現頭部震顫，身體偏向一側，行走不穩，向單側轉圈；假手術組無上述行為學改變；ZL各藥物組較模型組行為學改變程度減輕，高劑量組最為明顯。

2.2 各組Bax、Caspase-3表達

ZL各藥物組與模型組比較，均有不同程度降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；ZL高劑量組與低、中劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠黑質Bax、Caspase-3陽性細胞數比較（±s）

表1 各組大鼠黑質Bax、Caspase-3陽性細胞數比較（±s）

注：與假手術組比較，△ P＜0.01；與模型組比較，○ P＜0.01；與高劑量組比較，◇ P＜0.01。

分組 例數 Bax Caspase-3假手術組 5 168.20±7.43 110.00±7.91模型組 5 383.00±8.63△ 230.80±4.97△ZL低劑量組 5 305.20±5.93△○◇178.00±6.63△○◇ZL中劑量組 5 269.60±7.50△○◇152.00±5.34△○◇ZL高劑量組 5 225.20±6.54 △○136.20±3.42 △○

3 討 論

PD在中醫學中屬“顫證”范疇。中醫典籍《皇帝內經》中載有“諸風掉?！?、“行則振掉”、“掉振鼓栗”等，提出本病主要臨床表現為肢體搖動[4]。PD病因病機較為復雜，臨證多以滋補肝腎、補腎活血、益氣養血、熄風止顫、養肝柔筋為治法遣方用藥[5]。蛭龍活血通瘀膠囊具有益氣活血、祛風通絡功效，臨床治療帕金森病具有良好療效[6]。現代醫學研究證實細胞凋亡在PD病的發病機制中起重要作用[7]。Caspase-3在中腦黑質神經元的缺失是PD的主要病理特點[8]。細胞在受到凋亡刺激信號后趨向于凋亡，bax蛋白呈高表達，進而調節caspase-3活化，導致神經元損傷增加細胞凋亡[9]。文獻報道[10、11]，魚藤酮具有較強親脂性可通過血腦屏障，選擇性抑制線粒體復合物Ⅰ的活性，引起氧化應激和細胞凋亡，其誘導的PD模型能夠重現行為學改變及病理學特征，接近人類PD疾病表現，因此本課題采用魚藤酮進行PD大鼠模型制備，觀察凋亡相關蛋白表達情況。本實驗研究表明，蛭龍活血通瘀膠囊能夠改善PD大鼠的行為學表現，減少凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3在中腦黑質區域的表達，由此可見，蛭龍活血通瘀膠囊可能通過降低凋亡相關蛋白在腦內的表達從而發揮治療帕金森病的作用。