多粘菌素B對鮑曼不動桿菌生物膜形成的影響研究

阮四維，王海鑫，張妙英，蔣文靜，周訓(xùn)竹，曹棟卿，周 燕*

0 引言

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumanii)是臨床尤其在ICU內(nèi)多重耐藥和院感最主要的細(xì)菌之一[1-2]，其泛耐藥及多耐藥特性與其生物膜的形成有關(guān)，生物膜狀態(tài)下細(xì)菌可以抗消毒劑，抗人體的免疫系統(tǒng)，使感染持續(xù)存在且難以治療[1]。既往對多重耐藥鮑曼不動桿菌的研究多集中于其攜帶的耐藥基因直接導(dǎo)致的耐藥，本研究分析形成生物膜的相關(guān)特性及多粘菌素B作用于多重耐藥鮑曼不動桿菌的最低抑菌濃度、與生物膜形成存在可能關(guān)聯(lián)性的基因[3]、最低生物膜清除濃度以及殺菌機制，為臨床治療多重耐藥鮑曼感染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 選取溫州某三甲醫(yī)院2016年2-10月ICU氣管插管患者分離出的鮑曼不動桿菌42株。入選標(biāo)準(zhǔn)：①患者臨床有感染癥狀，根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會醫(yī)院獲得性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)判定為醫(yī)院獲得性肺炎。②連續(xù)痰培養(yǎng)2次以上，結(jié)果為鮑曼不動桿菌優(yōu)勢生長。

1.1.2 主要試劑和儀器 細(xì)菌檢定卡購自英國Oxoid公司，藥敏紙片購自法國梅里埃公司，硫酸多粘菌素B購自上海鼓臣生物技術(shù)有限公司；氨溴索購自常州四藥制藥有限公司。VITEK-2全自動微生物鑒定儀由法國梅里埃公司生產(chǎn)，電鏡由日本JOEL株式會社生產(chǎn)，基因擴增儀由杭州博日公司生產(chǎn)，凝膠成像儀為美國BIO-RAD公司生產(chǎn)。質(zhì)控菌株采用衛(wèi)生部臨床檢驗中心提供的大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗 鑒定方法和結(jié)果判定均按照操作說明書進行；藥敏試驗應(yīng)用微量肉湯稀釋法，結(jié)果判斷按美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會CLSI2019標(biāo)準(zhǔn)判讀。

1.2.2 生物膜形成能力檢測 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板構(gòu)建生物膜模型，結(jié)晶紫半定量法篩選出成膜能力不同的菌株，并用掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察鮑曼不動桿菌生物膜。

1.2.3 PCR檢測鮑曼不動桿菌生物膜相關(guān)基因 煮沸法提取鮑曼不動桿菌DNA，擴增abal、bfs、CsuE、ompA及blaPER-1基因，引物序列及擴增條件見參考文獻[4]，由上海華大公司合成。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA marker對照確認(rèn)是否含陽性片段，隨機各挑選2株產(chǎn)物送至上海華大基因公司進行純化并測序。

1.2.4 胞外多糖及蛋白含量測定 參照文獻方法[5]，采用苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍染液結(jié)合法分別檢測多粘菌素B用藥前后鮑曼不動桿菌的胞外多糖和黏附蛋白含量。

1.2.5 藥物對鮑曼不動桿菌的最低抑菌濃度、生物膜清除濃度測定 參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會CLSI2019標(biāo)準(zhǔn)方法，相同藥物濃度多粘菌素B作用鮑曼不動桿菌生物膜。選取24 h和48 h生物膜培養(yǎng)物電鏡掃描和激光共聚焦顯微鏡觀察病原菌生物膜。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計應(yīng)用SPSS 18.0軟件，計數(shù)、計量資料比較分別采用χ2檢驗及t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗 試驗結(jié)果顯示，有2株(4.8%)鮑曼不動桿菌對所有藥物均敏感，35株(83.3%)對3種以上藥物耐藥，具體見表1。所有鮑曼菌株頭孢他啶的MIC>512 μg/ml，哌拉西林的MIC>512 μg/ml，5株鮑曼不動桿菌對亞胺培南的MIC>512 μg/ml，2株鮑曼不動桿菌對亞胺培南的MIC為512 μg/ml，美羅培南的MIC>512 μg/ml，頭孢吡肟的MIC>512 μg/ml，阿米卡星和環(huán)丙沙星的MIC>512 μg/ml，左氧氟沙星的MIC≥256 μg/ml，具體藥敏結(jié)果見表1。多粘菌素B的MIC有梯度，7株(16%)鮑曼不動桿菌的MIC為0.5 μg/ml，19株(46%)鮑曼不動桿菌的MIC為1 μg/ml，6株(15%)鮑曼不動桿菌的MIC為2 μg/ml，10株(23%)鮑曼不動桿菌的MIC>128 μg/ml，比例見圖1。

表1 鮑曼不動桿菌藥敏試驗結(jié)果[株(%)]

圖1 鮑曼不動桿菌多粘菌素B的MIC(μg/ml)

2.2 鮑曼不動桿菌生物膜形成能力分析 多重耐藥鮑曼不動桿菌與敏感株24 h、48 h吸光度檢測顯示其成膜能力有差異，多重耐藥株更容易形成生物膜。見表2。

表2 鮑曼不動桿菌耐藥菌和非耐藥菌不同培養(yǎng)時間OD550值

注：*1t=16.008，P<0.001；*2t=7.214，P<0.001

2.3 PCR檢測鮑曼不動桿菌生物膜相關(guān)基因 42株鮑曼不動桿菌檢出abal、bfs、CsuE、ompA及blaPER-1基因均在70%左右，χ2檢驗顯示,5種基因在多重耐藥株和敏感株中差異無統(tǒng)計學(xué)意義。具體結(jié)果及統(tǒng)計學(xué)分析見表3。

表3 鮑曼不動桿菌生物膜相關(guān)基因及統(tǒng)計學(xué)分析[株(%)]

2.4 胞外多糖及蛋白含量 多重耐藥鮑曼不動桿菌胞外多糖和胞外蛋白的測定結(jié)果見表4。從表4可以發(fā)現(xiàn)，多粘菌素B對鮑曼不動桿菌胞外蛋白和胞外多糖的形成均有明顯作用。

表4 多重耐藥鮑曼不動桿菌胞外多糖(A490)蛋白(A595)測定結(jié)果(μg/ml)

2.5 掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察和測定藥物作用前后生物膜 耐藥鮑曼不動桿菌經(jīng)培養(yǎng)后，形成形狀不同的條索狀或斑片狀固著物,成團或相互交叉的生物膜。用藥后可見大部分斑片狀固著物相互聚集成團固縮，附著面積減小，小部分固著物剝離，無規(guī)律散在。見圖2、圖3。

本實驗采用2種染料對所研究的鮑曼不動桿菌進行雙重染色:用FITC標(biāo)記的刀豆蛋白A(FITC-Con A)與生物膜中的多糖結(jié)合發(fā)出綠色熒光,碘化吡啶(PI)與菌體內(nèi)的DNA結(jié)合,可發(fā)出紅色熒光，在蓋玻片上形成生物膜，在用藥前和用藥后取出玻片，采用雙重免疫熒光技術(shù)標(biāo)記多糖和細(xì)菌,并用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察生物膜形成情況。由圖4、圖5可觀測到耐藥鮑曼不動桿菌在用藥前后成膜量的變化，結(jié)果表明，成膜能力隨著用藥劑量的增長而下降。

圖2 耐藥株用藥前掃描電鏡生物膜形態(tài)

圖3 耐藥菌用藥后掃描電鏡生物膜形態(tài)

圖4 耐藥株用藥前共聚焦生物膜形態(tài)

圖5 耐藥菌用藥后共聚焦生物膜形態(tài)

3 討論

生物膜的形成是細(xì)菌耐藥的機制之一，50%的院內(nèi)感染與醫(yī)療器械裝置上的生物膜相關(guān)聯(lián)[6-7]，生物膜保護細(xì)菌免受宿主的獲得性免疫應(yīng)答以及吞噬細(xì)胞的捕食，使其耐藥性提高10～1 000倍[8]。本研究菌株來自ICU氣管插管，其體外培養(yǎng)均顯示極易形成生物膜。而多重耐藥菌較敏感菌株更易形成生物膜，顯示其多重耐藥與生物膜形成的協(xié)同效應(yīng)，與其他研究結(jié)果一致[9-10]。研究顯示，形成生物膜的菌株對不同藥物的耐藥性存在一定差異，對氨芐西林-舒巴坦、阿米卡星、環(huán)丙沙星、頭孢他啶有較高耐藥性，而對亞胺培南和哌拉西林的耐藥性較低[11-12]，但本次分離菌株對不同藥物沒有明顯差別，要考慮其他耐藥機制導(dǎo)致對藥物的耐藥性。

abal、bfs、CsuE、ompA、blaPER-1為菌毛裝配、形成和黏附生物表面的相關(guān)基因，研究表明，鮑曼不動桿菌依靠菌毛黏附物體表面，其黏附力強，不易被外力清除，繼而形成微菌落，隨著菌落擴大，生物膜進一步成熟[13]，因此，這些基因也被認(rèn)為是生物膜的相關(guān)基因，有一個或數(shù)個基因缺失的鮑曼不動桿菌則不易形成生物膜[14]。本研究35株多重耐藥菌中，23株(65.71%)均檢測到了所有的基因，在7株敏感株中均存在一定的基因缺失。因而影響其生物膜形成能力，但結(jié)果也需要排除實驗特異性的影響因素，可能存在一定的不足。

多粘菌素B是從多粘桿菌培養(yǎng)液中分離得到的一種環(huán)肽類抗生素，主要作用于革蘭陰性菌細(xì)胞壁，能與其外膜的脂多糖(LPS)結(jié)合，導(dǎo)致外膜通透性改變，最終通過細(xì)菌的“自發(fā)攝取通路”達到殺菌的目的[15]。多粘菌素B通過破壞鮑曼不動桿菌的細(xì)胞膜，對細(xì)菌外膜具有快速穿透性的特點，導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)主要物質(zhì)外漏[16]。同時，有研究表明，類多粘菌素B與RND外排泵AcrAB-TolC和AdeABC以及非RND外排泵Norm具有最高的結(jié)合親和力[17]，外排泵是一種位于細(xì)菌細(xì)胞膜上的胞外蛋白質(zhì),能將進入細(xì)菌內(nèi)的抗菌藥物泵出，同時也是構(gòu)成細(xì)菌生物膜的重要組成部分。本研究顯示，用藥后多重耐藥鮑曼不動桿菌胞外多糖和胞外蛋白含量均明顯減少，電鏡和激光共聚焦顯微鏡下均可觀察到生物膜明顯縮小，因此，可用于臨床鮑曼不動桿菌的治療。但多粘菌素B對腎臟的損害較多見，腎功能不全者應(yīng)減量。

綜上所述，生物膜的形成是鮑曼不動桿菌耐藥的重要機制之一，多粘菌素B對易形成生物膜的多重耐藥菌有較好的抑制作用，適宜在普通抗菌藥物治療效果不明顯時選擇使用。