豬內源性逆轉錄病毒及其敲除抑制方法

張健民 李 陽

（1.南方醫科大學珠江醫院再生醫學研究所，廣東 廣州，510282；2.南方醫科大學珠江醫院肝膽二科，廣東 廣州，510282）

引言

目前，供體的極度短缺是器官移植所面臨的最大的障礙，很多患者在等待供體器官中死去。雖然國家采取了多項措施用于鼓勵和推廣器官捐贈，但并沒有有效解決我國器官供體嚴重短缺現象。目前，異種器官移植被認為是解決供體器官短缺現狀的一種有效方法。其中，豬由于具有以下優點：1、豬的心血管系統、消化系統、皮膚、營養需要、骨骼發育以及礦物質代謝等都與人的情況極其相似；2、豬的主要臟器器官與人類大小相近；3、豬基因多樣、繁殖周期短、生產力高，一窩產仔多，便于根據特殊需要進行選育；因此，被認為是異種移植器官組織來源的最佳供體。但使豬成為異種移植器官供體仍有很多障礙需要克服，這主要包括免疫排斥和致病微生物的傳播。早在十幾年前科學家就開始對豬進行免疫學改造，以解決免疫排斥問題。對于豬體內的病原微生物，其絕大多數真菌、細菌、病毒可通過SPF級培育凈化去除，但豬基因組內存在的PERV難以通過凈化培育去除。本文對PERV的特征及抑制其表達的方法進行了綜述。

1 PERV簡介

1.1 PERV分子特性：

PERV的基因組為單股正鏈線性RNA，長約7-9kb，由兩端的非編碼區和中間的gag、pol、env三個編碼區組成。Gag編碼病毒的核心蛋白；pol基因編碼病毒復制所需的酶類，主要有蛋白酶（PR）、逆轉錄酶（RT）和整合酶（IN）；env基因編碼囊膜糖蛋白，主要包括表面蛋白（SU）gp70和穿膜蛋白(TM)p15E。根據PERV env基因編碼的不同，可以將PERV分為三個亞型：PERV-A、PERV-B、PERV-C，其差異主要在于SU表面糖基化的VRA、VRB和PRO區，這種差異可能導致不同類型的PERV有著不同的宿主感染范圍。

PERV的基因序列不保守：巴馬小型豬PERV（PERV-BM）株為進化株A亞型的進化分支[1]，以PERV-BM基因序列為基準，將其與GenBank數據庫公布的17株不同亞型的PERV序列進行全基因序列同源性比對分析，結果表明PERV-BM與同樣來自中國的EF133960 CA亞型)同源性最高，為97.1%；與英國的KC 116219 C同源性最低，為88.4%，PERV呈現不保守性。

圖1 PERV-巴馬株與其它各亞型PERV之間的核苷酸序列同源性比較（1）

圖2 PERV巴馬株的系統進化樹分析（1）

1.2 PERV的分布：

PERV在不同豬種和組織中分布情況不同。對PERV感染和分布情況可以通過直接檢測病毒DNA、病毒mRNA及相關病毒蛋白的存在來證明PERV感染，也可通過檢測病毒產物來間接證明存在PERV病毒感染[2][3][4]。利用PCR、實時PCR[5][6][7]、Southern blot[8]等方法可以直接檢測出病毒前DNA的存在；通過對PERV設計引物和探針還可以直接檢測出細胞中PERV的拷貝數[9]；通過FISH可檢測出PERV前DNA在染色體中的位置[10][11]；PERV所表達RNA的水平可通過RT-PCR的方法進行檢測[12]；其相關蛋白的表達，可通過 Western blot、免疫組化等方法進行檢測[13][14]。通過檢測RT等酶的活性可以間接驗證PERV的存在[15]。Sai P.[16]等通過western blot和RT-PCR等方法從蛋白和mRNA水平對不同豬種、不同臟器組織中PERV的表達進行了檢測，發現PERV表達水平都不盡相同。以Q-PCR等方法檢測不同豬種組織臟器中PERV前DNA拷貝數，發現不同豬種不同組織來源細胞中PERV前DNA拷貝數也不相同（表1）。

表1 各種豬源組織細胞中PERV拷貝數

豬基因組學研究顯示在豬的基因組中PERV前DNA拷數為10到100[8][21][22][23]不等，Ramis G[24]等驗證了PERV的拷貝數與豬的雜合性無關聯。對六種不同的豬亞種（Large White pig、Westran pig、Korean pig、Wild boar、Yucatan mini pig、d/d mini pig）豬基因組中的PERV 分布情況進行檢測，發現PERV可存在于豬的各條染色體上，在每個染色體中的 拷貝數在0-5之間，但其在每條染色體上的分布規律尚未發現。[25][26][27][28][29][30]。Clemenceau B[16]等還對SPF培育豬中PERV mRNA的表達量進行了檢測，發現所有組織中均可檢測到PERV的表達。其中，以腎臟中PERV的表達量最高，肝臟、肺和心臟其次，胰臟中PERV的表達量最低。PERV在不同組織表達量的差異是由于PERV的LTR在不同組織中轉錄活性的不同造成的[31][32]。SPF豬和普通豬中PERV的表達量沒有明顯的差異，說明SPF培養不能夠去除豬基因組中的 PERV，SPF豬并不能夠降低異種移植時PERV傳染給人的風險。

1.3 PERV的感染過程：

首先，PERV的跨膜蛋白先與靶細胞膜融合，使病毒的核心部分進入靶細胞內。在逆轉錄酶的作用下，病毒基因組RNA復制形成雙鏈的DNA，雙鏈DNA再在整合酶的作用下整合到靶細胞基因組中，并以前DNA的形式存在。PERV前DNA成為細胞基因組的永久成分，隨宿主細胞DNA的復制而復制。前病毒DNA可以在宿主細胞RNA聚合酶II的作用下，轉錄生成病毒RNA，再經過加工形成mRNA。在mRNA的指導下進一步形成病毒相關蛋白，主要包括核心蛋白、表面蛋白、穿膜蛋白以及功能酶類（蛋白酶、反轉錄酶、整合酶）。待病毒RNA基因組和結構蛋白都形成后，病毒就開始自我裝配，并以出芽的方式從細胞膜上釋放出來，感染其他細胞。

1.4 PERV的感染特性：

現已證實，多種類型的豬細胞都存在PERV感染，可以釋放PERV病毒顆粒，在體外培養條件下PERV可以感染多種人源細胞[33]。PERV-A和PERV-B的宿主范圍較寬，不僅可以感染豬、貂等動物細胞，也可以感染人類的293、TE671、Hela、U87等細胞系；PERV-C目前僅發現它可以感染2種豬細胞系和一種人細胞系；PERV-A和PERV-C會形成重組體PERV-A/C，其感染人細胞的能力遠高于PERV-A。因此，宜選擇PERV-C陰性豬作為異種器官移植的供體來源。Luc JW等研究表明PERV能夠跨物種間體內感染。他們先進行了體外培養條件下，跨物種間細胞感染實驗，發現豬的胰島細胞可釋放PERV顆粒，并能夠感染體外培養人細胞，。之后他們將豬的胰島移植入NOD/SCID鼠體內(非肥胖糖尿病鼠伴嚴重的免疫功能低下)，在移植后的鼠脾、肝、腎、小腸等若干組織細胞內都檢測到了PERV的表達[34]。對于PERV在體內條件下能否感染人體組織細胞，Paradas等對160名接受豬活體組織治療的患者進行了PERV感染情況的追蹤調查，其中脾灌流100人，豬源性生物人工肝HEPAT Assist儀治療28人，豬皮移植15人，豬胰島細胞移植14人，體外腎灌流2人，豬整肝灌流1人，追蹤調查的這12年內，這些患者均未出現病毒血癥；對PERV感染進行檢測，有159人(97%)未檢出PERV感染，有23人存在微嵌合(PERV DNA及豬特異DNA雙陽性)，繼續觀察8.5年，均未有PERV感染發生[35]。雖然PERV能否感染人體組織細胞仍然存在爭議，但目前尚不能排除豬器官移植人體后存在PERV感染的風險。豬器官移植靈長類后，最長存活時間已超過365天，還未有豬器官中PERV在長期條件下，是否會感染靈長類的研究。目前也沒有更多豬器官移植人體及其PERV感染情況的報道。為了避免豬器官移植人體后存在PERV感染的風險，有必要去除豬基因組中PERV基因，以解除PERV感染人體的風險，為異種移植奠定基礎。

2 PERV的抑制和消除

目前，對PERV進行抑制和消除的方法主要有三種，包括1）通過抑制病毒反轉錄酶和整合酶活性抑制PERV的感染；2）通過RNAi的方法抑制PERV的表達；3）通過基因編輯技術對基因組中PERV的前DNA序列進行敲除。

圖3 PERV感染過程及其抑制和消除

2.1 反轉錄酶（RT）和整合酶（IN）活性的抑制：

PERV的Pol編碼區編碼病毒所需的多種酶類，其中最主要的三種為：蛋白酶、反轉錄酶、整合酶。通過抑制病毒復制、整合所需酶類的活性，可抑制病毒感染。

2.1.1 整合酶活性的抑制：

整合酶的作用是將PERV的前DNA整合到宿主基因組中。目前已證明二酮酸類化合物可抑制細胞內整合酶活性。其作用機制是二酮酸類化合物可以與病毒DNA和整合酶結合所形成復合物催化核心區域中的二價金屬相結合，從而阻止了復合物與宿主DNA的結合，抑制了病毒DNA與宿主DNA的整合。

雷特格韋（Raltegravir、RAL）是一種常用整合酶抑制劑，RONFORT Corinne[36]等分別在分子水平和細胞水平證實了RAL能夠有效抑制PERV整合酶的活性。在分子水平，當RAL的濃度達到400nM時，IN活性下降90%；細胞水平，在10nM RAL濃度處理下感染了PERV的293T細胞在經過了39天的處理后感染了PERV的比例幾乎為零，而對照組中的感染了PERV的293T細胞達到了100%。說明了RAL能夠有效的抑制PERV整合酶活性。

2.1.2 反轉錄酶活性的抑制：

反轉錄酶具有多種酶活性，現已被證明其具有聚合酶活性和RNA H活性。聚合酶可以以DNA或RNA為模板，合成一條新的DNA鏈，RNA酶H再特異性的降解RNA-DNA雙鏈中的RNA鏈。逆轉錄酶抑制劑可以抑制病毒RNA的復制，從而抑制PERV的表達。逆轉錄酶抑制劑主要包括兩種：核苷類逆轉錄酶抑制劑（NRTIS）和非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTIS)。

Joachim Denner、F.X.Wilhelm、WALID HENEINE[37][38][39]等研究者檢測了十余種NRTIS和NNRTIS對PERV逆轉錄酶的抑制效果，其中AZT和ddGTP效果較明顯，AZT的濃度達1uM時，逆轉錄酶活性最低。

2.2 RNAi抑制PERV的表達

RNA干擾是生物界普遍存在的一種抵御外來基因和病毒感染的保守進化機制，其本質是siRNA與靶向mRNA特異性結合，并由RISC介導mRNA降解，從而沉默靶向基因。

許多研究者利用siRNA干擾降解PERV編碼區mRNA從而抑制PERV的表達。Joachim Denner、Y GAO[40][41]等針對PERV編碼區的相對保守區域gag、pol序列設計siRNA，用來抑制PERV的表達，并通過RT-PCR驗證了各個siRNA干擾PERV表達的效率，發現siRNA pol2的抑制效果最顯著。

Ryota Shirakura、David Ayares、Joachim Denner、Y GAO[40][41][42][43][44]等十余研究團隊都成功利用siRNA有效的抑制了PERV的表達。Joachim Denner等使用慢病毒載體攜帶siRNA-pol2轉染豬成纖維細胞，轉染后的成纖維細胞較對照組PERV的表達量明顯降低。他們再利用體細胞核移植技術以PERV抑制細胞為供體，制作出了克隆豬。該克隆豬所有的組織器官基因組中都可檢測出siRNA-pol2的轉入，并且克隆豬PERV的表達量也較野生型豬有顯著降低。他們再以分出的陽性豬成纖維細胞進行再克隆，再克隆豬PERV的表達量較對照組也有顯著下降。

2.3 PERV敲除

由于PERV在豬基因組中拷貝數較多，利用傳統敲除方法無法實現完全敲除，之前研究多利用RNAi技術對PERV表達進行抑制。在ZFN、TALEN、Crispr/Cas9等高效基因編輯技術之后，使對PERV的完全敲除成為可能。

2.3.1 ZFN敲除PERV序列

Joachim Denner[45]等首先使用ZFN敲除細胞系中的PERV。轉染后的細胞系中可檢測到ZFN的表達，但是較對照組相比PERV拷貝數以及其mRNA表達量無明顯差異。ZFN未能有效的敲除細胞系中PERV，這可能是由于ZFN打靶效率相對較低導致的。

2.3.2 Crispr/Cas9敲除PERV

Crispr/Cas9打靶技術出現后，George Church、Luhan Yang[19]等利用CRISPR/Cas9技術成功的滅活了PK15細胞中的多達62個拷貝的PERV序列。他們針對PERV保守序列pol區設計gRNA后連入PB轉座子載體中，構建成PB-Cas9/2gRNAs載體。將PB-Cas9/2gRNAs載體轉入PK15細胞，PK15細胞可持續高效的表達靶向PERV序列Cas9和gRNA，從而導致PK15細胞中的62個PERV拷貝全部發生了堿基的插入或者缺失。被基因編輯的PK15細胞喪失了感染HEK293細胞的能力，62個PERV拷貝全部被滅活。

3 結論

PERV是已整合在豬的基因組中的內源性逆轉錄病毒，整合酶抑制劑、逆轉錄酶抑制劑、siRNA干擾等方法都能在一定程度上抑制的PERV的表達。但是通過這些方法，只是抑制了PERV的表達，PERV前DNA仍然存在與豬的基因組中，其潛在危險性仍未被去除。利用ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因編輯技術對其進行敲除時，由于PERV基因序列的不保守性，即使在相對保守的gag、pol區域仍有許多不保守的序列，增加了將其從豬基因組中完全去除的難度。并且PERV有較強的自我修復能力，敲除的堿基數小于10bp，或其拷貝數敲除不完全時，可能只發生短暫的失活或表達降低，在殘余PERV序列作用下，又迅速恢復其活性。因此，在個體水平對PERV進行完全敲除，制作無PERV的異種器官移植供體豬仍存在很多困難。George Church等已成功利用Crispr/Cas9技術將PK15細胞中62個拷貝的PERV失活。Crispr/Cas這一高效基因打靶技術的出現，使在個體水平對豬PERV序列進行完全敲除成為可能。今后，可以以同樣的技術對體細胞PERV進行敲除，獲得無PERV的體細胞后，再進行克隆豬制作，以獲得無PERV豬。筆者所在實驗室已通過CRISPR/Cas9技術實現了對豬的基因修飾，并已培育出基因修飾豬30多種[46][47]，目前正在進行無PERV豬的培育工作。無PERV豬培育成功后將極大推動異種器官移植的發展。