粗糙脈孢菌產纖維素酶活力條件分析

李笑峰 張玲秀 趙二勞

(1.忻州師范學院化學系，山西 忻州 034000;2.忻州師范學院生物系，山西 忻州 034000)

纖維素能夠轉化為乙醇、可溶性糖以及一些其它工業化合物等可利用物[1]，而利用纖維素酶水解纖維素實現其轉化是一條環保、高效、無污染的有效途徑[2]。在酒精發酵時添加纖維素酶可顯著提高酒精或白酒生產中的原料利用率[3]，利用纖維素酶分解農作物秸稈可充分、有效利用農作物秸稈。因此，纖維素酶的生產對人類社會發展具有重要的意義。但纖維素酶生產周期長、成本相對較高，且產率和活力相對較低，所以其工業化應用受到限制[4]。因此，選育產生纖維素酶的新菌種，從而降低成本、提高纖維素酶產量和活力受到廣泛關注[5]。粗糙脈孢菌能夠合成纖維素酶、半纖維素酶和木質素酶，同時可避免由纖維二糖積累引起的反饋抑制[6]。本研究在前期對粗糙脈孢菌產纖維素酶工藝優化研究[5]的基礎上，進一步研究溫度、pH及金屬離子Zn2+、Mg2+、K+和Cu2+等對所產纖維素酶活力的影響，為深入研究粗糙脈孢菌產纖維素酶的機制及其工業化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料與試劑：粗糙脈孢菌(NeurosporacrassaQF)(實驗室保存)，酒石酸鉀鈉，3,5-二硝基水楊酸，Sephadex G-75，葡萄糖，磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、七水硫酸鐵和七水硫酸鋅等，均為國產分析純，蛋白胨、酵母浸粉和麥芽糖等為國產生化試劑。

儀器：UV-2102C型紫外分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司), PHSJ-5型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司), HC-3018高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司),FA2004N電子天平(上海箐海儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1菌種活化

保存菌種連續轉接PDA試管斜面活化三次。

1.2.2葡萄糖標準曲線的繪制

采用DNS法，并參考文獻[5]的方法繪制。

1.2.3粗酶液的制備

在250 mL的錐形瓶中裝入80 mL產酶培養基，接入5%菌種，在28 ℃、150 r/min的搖床中培養5天。取培養液于4 ℃高速離心10分鐘，上清液即為粗酶液。

1.2.4鹽析

按60%、70%和90%不同硫酸銨飽和度進行分級沉淀，根據純化結果，分析比較出最佳硫酸銨液飽和度。

1.2.5層析

試驗采取Sephadex G-75分子篩層析技術對酶進行進一步的分離純化。

1.2.6纖維素酶活力的測定

在酶催化下，每1 mL酶1 min產生0.01 mg葡萄糖定義為一個酶活單位。取層析后酶液1.0 mL，再加入1 cm×1 cm的濾紙片，加入0.5 mL pH4.8醋酸緩沖液，反應30 min后，加入DNS溶液2 .0 mL，搖勻后沸水浴5 min，以10000 r/min 離心5 min，取上清液在波長550 nm處測定吸光值。

1.2.7溫度對酶活力的影響

分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下測定纖維素酶活力，研究溫度對酶活力的影響。

1.2.8pH對酶活力的影響

分別在pH 4.0、4.4、4.8、5.2、5.6條件下，測定纖維素酶活力，研究pH對酶活力的影響。

1.2.9金屬離子Zn2+、Mg2+、Cu2+和K+離子濃度對酶活力的影響

酶反應系統中調整各離子濃度分別為0.0 mg/mL、0.004 mg/mL、0.04 mg/mL、0.08 mg/mL、0.12 mg/mL、0.16 mg/mL、0.20 mg/mL，測定不同離子濃度下纖維素酶活力，研究離子及其濃度對酶活力的影響。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

以葡萄糖濃度為橫坐標，其吸光度值為縱坐標，繪制葡萄糖標準工作曲線如圖1。求得工作曲線方程為：A=0.504C-0.039 1，相關系數R2=0.994 0。可知，在葡萄糖質量濃度為0.2～1.2 mg/mL的范圍內，線性關系良好。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig. 1 Standard curve glucose

2.2 鹽析和層析結果

測定不同飽和度的硫酸銨溶液分別沉淀粗糙脈孢菌所產胞外纖維素酶的活力，結果如圖2所示。由圖可知，70%飽和度硫酸銨溶液所得纖維素酶活力最高。

圖2 不同硫酸銨飽和度沉淀纖維素酶的活力Fig. 2 Activity of cellulase precipitated by different ammonium sulfate saturation

為了檢測所獲酶純度，將上述步驟獲得的纖維素酶，進行透析脫鹽后再通過Sephadex G-75層析，如圖3所示其純度較好，重新收集40 min～87 min的收集液，再經無水乙醇沉淀即獲得較純纖維素蛋白酶。

圖3 70%飽和度硫酸銨沉淀蛋白層析效果Fig. 3 Result of the chromatography of protein precipitated by ammonium sulfate at 70% saturation

2.3 溫度對纖維素酶活力的影響

分別選取30℃、40℃、50℃、60℃、70℃進行酶的活力測定，研究溫度對所產纖維素酶活力的影響，結果如圖4。可見溫度為50℃時，所產纖維素酶活力最強，與其他溫度相比有顯著差異(P< 0.05)。

圖4 溫度對纖維素酶活力的影響Fig. 4 Effect of temperature on cellulase activity

2.4 pH對纖維素酶活力的影響

酶的催化活力與環境pH有關，在pH分別為4、4.4、4.8、5.2和5.6時，測其酶的活力，結果如圖5。

圖5 pH對纖維素酶活力的影響Fig. 5 Effect of pH on cellulase activity

由圖5可知，隨著pH值的上升，纖維素酶活力呈先升后降趨勢，pH為4.8時，纖維素酶的活力最高。

2.5 金屬離子對纖維素酶活力的影響

測定金屬離子Zn2+、Mg2+、Cu2+和K+對纖維素酶活力的影響如表1。由表1可知，Zn2+、Mg2+和Cu2+對所產纖維素酶活力具有一定的抑制作用，且有劑量效應。K+對纖維素酶活力具有一定的激活作用，在0.16 mg/mL時激活作用最強。一般來說，金屬離子對纖維素酶活力的影響有兩種作用，即激活和抑制，原因可能是通過配位機理穩定過渡態或引起pKa改變，對酶活力的促進作用也可能是因為其與酶活性中心結合后更易于纖維素的結合，增強水解效果，發揮了協助功能[7]。

表1 金屬離子對纖維素酶活力的影響

3 討論

我國作為一個農業大國，農作物秸稈極為豐富，但由于處理費用高且經濟效益差，往往不能很好的利用。每年春季，農田中焚燒秸稈造成嚴重的空氣污染。為了解決這一問題，國內外目前采用首先將秸桿前期處理，即通過化學、物理、酶、微生物發酵等方法將其降解為次級產品，再經酵母發酵最終生產乙醇等產品。其中秸稈前期處理首選酶法，因為其具有工業化程度高，降解效率高等優點，但是酶相對價格較高、穩定性差，導致生產成本較高，制約了其的推廣應用。研究價廉高效的纖維素酶生產成為人們極感興趣的課題。

本實驗以一株粗糙脈孢菌為材料，其所產纖維素酶活力高于里氏木酶，具有一定的應用潛能。通過對所產纖維素酶催化條件分析，以期提高其活力，降低其生產成本。

4 結論

經硫酸銨分級鹽析，葡聚糖凝膠層析純化的粗糙脈孢菌所產纖維素酶，在溫度50℃、pH 4.8條件下，活力最高。Zn2+、Mg2+和 Cu2+抑制所產纖維素酶活力，K+可激活所產纖維素酶活力。