高效液相色譜法測定紅曲發酵食品中洛伐他汀的研究

張星星 ，毛清黎*，孫 俊，周念波，鐘小丹，吳季勤，顏 澤，陶 鑫，張 潔

（1.武漢生物工程學院校企共建功能米酒研發中心，湖北武漢 430415；2.武漢生物工程學院食品科技學院，湖北武漢 430415；3.湖北米婆婆生物科技股份有限公司，湖北孝感 432000；4.武漢生物工程學院生命科學與技術學院，湖北武漢 430415）

紅曲霉（Monascus）又名紅曲菌，主要采用大米為原料，接種紅曲霉進而發酵生產得到的一種紅色米曲，為我國一種較傳統的藥用真菌[1-3]。紅曲霉在發酵代謝過程中可產生紅曲色素、多糖、γ-氨基丁酸、麥角固醇、不飽和脂肪酸以及洛伐他汀等多種生理活性物質，既可用于食品著色、腐乳制作、釀酒和疾病治療等，又有抗菌、降血脂、降血壓等作用[4]，在食品和醫藥行業中有著非常廣泛的應用。目前國內市場上已有多種以紅曲為主要成分的中成藥，如“圣曲紅曲膠囊”和“血脂康”等，且療效顯著[3]。

洛伐他汀（lovastatin）為紅曲發酵中產生的一種生理活性物質，有閉環的內酯式和開環的β-羥基酸式兩種結構[5-6]。研究表明，洛伐他汀不僅可有效阻斷內源性膽固醇的合成，還具有保護腎臟、抗動脈粥樣硬化、抗癌、抗炎等作用[7-8]，因而日漸受到國內外研究者的關注。市場上利用紅曲已開發出各類保健食品，如程亞運[9]利用絲苗米、紅曲米和棗汁按一定比例混合，接種紅曲霉預發酵48 h，然后接種酵母，按比例調節料水比發酵得到紅曲棗酒；李燚[10]通過添加紅曲，分別制作出了紅曲酸奶和紅曲米酒，并考察了紅曲菌絲體添加量對產品品質的影響，類似文獻報道較多[11]，但大多集中在產品工藝研究；另一方面，洛伐他的汀含量分析則主要為藥物產品，如謝靜等[6]采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對血脂康膠囊中洛伐他汀的含量進行了檢測，程杰等[12]建立了一種測定脂必妥膠囊中洛伐他汀含量的HPLC法，而關于紅曲發酵食品中洛伐他汀的檢測分析也有一些報道，如李濤等[13]優化了洛伐他汀有關物質的HPLC分析方法，莫永川等[14]建立了以紅曲為原料的保健食品中洛伐他汀含量測定的方法。

本研究根據洛伐他汀的結構特點，運用反相液相色譜系統[16-20]，以常見的紫外檢測器建立了一種紅曲發酵食品中的洛伐他汀類物質的高效液相色譜分析方法，并對該方法的準確度、精密度和重現性等問題進行了較為深入、系統地研究，同時將其應用于紅曲發酵食品的檢測中，為功能性紅曲發酵食品的質量評價提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

洛伐他汀標樣（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司；磷酸、乙醇（均為分析純）：國藥控股股份有限公司；甲醇（色譜純）：天津科密歐試劑有限公司；實驗用水為超純水；紅曲：廣州市威倫食品有限公司；紅曲米酒、紅曲米：校企共建功能米酒研發中心實驗室自制。

1.2 儀器與設備

CH-4數顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市宏華儀器廠；Waters1525高效液相色譜儀：美國Waters公司；DHG-9055A實驗室數顯干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；BQS超聲波清洗儀：杭州寶珀超聲波科技有限公司；ME204T/02電子分析天平：梅特勒-托利多國際有限公司；TDZ5-WS臺式離心機：上海向帆儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 洛伐他汀標準溶液配制

內酯式洛伐他汀標準溶液的配制：精確稱取內酯式洛伐他汀20.0 mg，以色譜甲醇溶解后，定容至10 mL，即得2.0 mg/mL的內酯式洛伐他汀標準溶液。將其依次以甲醇稀釋至1.00 mg/mL、0.50 mg/mL、0.25 mg/mL、0.10 mg/mL、0.05 mg/mL等系列濃度。

酸式洛伐他汀標準溶液配制：準確移取上述2.0 mg/mL的內酯式洛伐他汀標準母液1 mL，加入0.2 mol/L氫氧化鈉-乙醇溶液至10 mL，充分混勻后，置于50 ℃下超聲清洗儀中，超聲轉化1 h，冷卻后靜置1 h，即為0.2 mg/mL的酸式洛伐他汀標準貯備液，后稀釋至相應質量濃度。

內酯式/酸式洛伐他汀混標的配制：取0.1 mg/mL內酯式洛伐他汀標準溶液1 mL和0.05 mg/mL酸式洛伐他汀標準溶液1 mL，進行混合，混勻后，運用高效液相色譜（HPLC）法進行測試分析。

1.3.2 洛伐他汀的HPLC分析條件

1.3.3 洛伐他汀標準工作曲線的繪制

將上述系列濃度的內酯式洛伐他汀標準溶液，按1.3.2的HPLC條件進行分析，記錄各質量濃度下的峰面積，以內酯式洛伐他汀標準溶液進樣質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線。

1.3.4 精密度實驗

取0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、1.00 mg/mL三種不同濃度的內酯式洛伐他汀標準溶液，對每種質量濃度下的標液進行一天測定5次及連續5 d的HPLC分析。根據記錄的峰面積計算其質量濃度，并得出分析結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），以評價上述方法的精密度。

1.3.5 加標回收率實驗

分別取洛伐他汀含量為0.25 mg/mL、0.50 mg/mL的兩種紅曲發酵食品樣品，向每種樣品中添加0.10 mL質量濃度依次為0（空白對照）、0.25 mg/mL、0.50 mg/mL的內酯式洛伐他汀標準溶液，混合均勻，按照1.3.2進行HPLC分析，記錄目標峰的峰面積，并計算出實際樣品濃度和樣品的加標回收率。

1.3.6 食品中洛伐他汀含量的檢測

固體食品：取10 g食品樣品，研磨過40目篩，稱取混勻后的篩下物2 g于20 mL具塞試管中，向其中加入20 mL 75%的乙醇溶液，于40 ℃水浴中超聲提取1 h，冷卻后，分裝至離心管中離心10 min，轉速為5 000 r/min，合并上清液過濾膜，進行HPLC分析。

液體食品：搖勻后取樣，準確移取1mL液體食品于20mL具塞試管中，向其中加入10 mL體積分數75%的乙醇水溶液，于40 ℃水浴中超聲提取1 h，冷卻后，分裝至離心管中離心10 min，轉速為5 000 r/min，合并上清液過濾膜，進行HPLC分析。

2 結果與分析

2.1 洛伐他汀標準液HPLC分析

取1.3.1中配制的洛伐他汀混標溶液1 mL，按照方法1.3.2液相色譜方法進行分析，其色譜結果見圖1。由圖1可知，酸式和內酯式兩種洛伐他汀的保留時間依次為22.54 min和27.21 min，兩目標峰峰形對稱性好，柱效較高，且分離度＞1.5，達到了基線分離的效果，效果非常顯著，這表明該色譜條件可作為兩種洛伐他汀的定性分析依據。

圖1 洛伐他汀標準品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the lovastatin standard

2.2 洛伐他汀標準工作曲線的繪制

將方法1.3.1所配制的0.05～1.00 mg/mL系列濃度的內酯式洛伐他汀標準溶液按照方法1.3.2的色譜條件分別進行色譜分析，記錄各質量濃度色譜峰面積，以內酯式洛伐他汀的質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準工作曲線，結果見圖2。由圖2可知，線性回歸方程為Y=3.03×107X+263 113（R2=0.999 8），表明在0.05～1.00 mg/mL質量濃度區間內，線性關系良好，靈敏度高，完全滿足定量分析要求。

圖2 內酯式洛伐他汀標準工作曲線Fig.2 Standard curve of lactone lovastatin

2.3 精密度實驗結果

為考察方法的精密度，取0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、1.00 mg/mL 3種不同質量濃度的內酯式洛伐他汀標準溶液，對每種質量濃度下的標液進行1 d內測定5次以及連續5 d的HPLC分析，實驗結果見表1。由表1可知，日內5次重復測樣結果的相對標準偏差為1.25%～2.56%，回收率為96.12%～101.32%；連續日間5 d測樣結果的相對標準偏差為1.25%～2.64%，回收率為96.18%～102.01%。表明該方法具有較高的重現性、精密度和準確度。同時表1結果也反映了該方法處理的樣品具有很好的穩定性，標準樣品短時期的存放基本不會改變測定結果。然而該方法與測定藥品中的洛伐他丁的主要區別就在樣品的處理上，食品樣品組成復雜，因此對測定方法的要求則更高。

表1 精密度實驗結果Table 1 Results of precision experiments

2.4 加標回收率實驗結果

取已知洛伐他汀含量的紅曲發酵食品樣品，向其中添加一定量的內酯式洛伐他汀對照品，充分混勻后，按照方法1.3.2進行HPLC分析，記錄目標峰的峰面積，并計算出實際樣品中洛伐他汀濃度和樣品的加標回收率，結果見表2。由表2可知，所有食品樣品的加標回收率均在99.01%～102.40%范圍內，回收率結果相對標準偏差在1.53%～3.54%范圍內，表明該方法具備良好的精確度，可滿足分析要求。

表2 加標回收率實驗結果Table 2 Result of standard recovery rate experiments

2.5 紅曲發酵食品中內酯式洛伐他汀含量的檢測

為了考察本方法對實際紅曲發酵食品樣品的分析效果，實驗選取了紅曲、紅曲霉發酵的紅曲米酒以及紅曲米三種樣品，按實驗方法的步驟進行處理、分析，測試的結果見圖3。

圖3 幾種不同紅曲發酵食品樣品HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of different Monascus fermented food samples

由圖3可知，紅曲樣品譜圖干擾峰較少，對測定基本上沒產生影響，紅曲米酒樣品譜圖中在12～18 min出現了少量的干擾峰，但相比于目標物，其含量可忽略，紅曲米樣品譜圖中分別在8 min、16 min及20 min左右出現了干擾峰，且其含量較高，上述樣品譜圖的差異可能與紅曲發酵食品在制作過程中紅曲發酵所利用的底物及發酵條件不同，使得發酵食品產物成分較為復雜，此外，洛伐他汀與食品中其他各成分之間的結合能力也不同，導致溶劑提取時洛伐他汀的富集效果存在差異。雖然上述實際食品樣品成分比較復雜，但使用該方法測定時，譜圖中干擾峰較少，對測定基本上沒產生影響，說明該方法的選擇性很好，非常適合食品中洛伐他汀的測定。

從食品樣品中測得洛伐他汀平行3次結果見表3。由表3可知，檢測結果的RSD范圍在1.67%～4.85%，可知通過該方法檢測的食品中洛伐他汀含量重現性較好。比較3種食品中目標峰的大小可知，紅曲樣中洛伐他汀含量最高，平均含量為1.559 mg/g，而由其發酵的食品產品紅曲米和紅曲米酒中洛伐他汀含量則較低，充分說明了紅曲食品在發酵過程中，洛伐他汀有所損失，如何在食品發酵過程中更好的保留洛伐他汀對食品發酵工藝提出了新的要求。

表3 不同紅曲發酵食品樣品中內酯式洛伐他汀的含量Table 3 Lactone lovastatin content in different Monascus fermented food samples

3 結論

本文建立了一種HPLC法對紅曲發酵食品中的洛伐他汀類物質進行測定的方法。發酵紅曲食品樣品經體積分數75%乙醇溶解，在40 ℃水浴下超聲提取1 h后離心，使用InertSustainC1（8250 mm×10 mm，5 μm）色譜柱，采用甲醇/0.3%磷酸溶液75∶25（V/V）為流動相，等度洗脫，保持柱溫30 ℃，流速1 mL/min，UV波長λ=238 nm的色譜條件下分析35 min。結果顯示該法在0.05～1.0 mg/mL的質量濃度范圍內，線性關系良好，且日間和日內相對標準偏差分別為1.25%～2.64%、1.25%～2.56%，樣品的加標回收率為99.01%～102.40%，該法不僅操作簡便、測試成本低廉，對儀器設備要求也較低，同時具備良好的穩定性、準確度和精密度。在實際紅曲發酵食品樣品測試中干擾峰少，目標峰形對稱，非常適合食品樣品中洛伐他汀類物質的測定，可為功能性紅曲發酵食品的質量評價提供參考依據。