同時(shí)蒸餾與固相微萃取法對(duì)醬油香氣成分提取的比較研究

王軍喜，趙 瑩，白衛(wèi)東*，錢(qián) 敏，劉曉艷，趙文紅

（1.廣東粵師傅調(diào)味食品有限公司，廣東開(kāi)平 529341；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510225）

醬油主要以黃豆、小麥粉、食用鹽為原材料，利用微生物和酶共同作用，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的生物化學(xué)變化，賦予食物特殊的香味和特有的色澤，最終形成具有香氣醇厚、口感鮮美的液態(tài)調(diào)味品[1-2]。香氣物質(zhì)是醬油的靈魂[3]，關(guān)于醬油香氣典型的描述有醬香、豉香、酯香，因釀造者的理解存在差異，這三類(lèi)香氣沒(méi)有嚴(yán)格的定義。醬油中主要香氣成分的組成取決于原料、生產(chǎn)工藝及參與發(fā)酵的微生物等因素，另外，溫度、光照、壓力及環(huán)境污染物等外界因素也會(huì)影響醬油香氣成分組成[4-6]。醬油的香氣很復(fù)雜，因此選擇合適的前處理方法才能真實(shí)、準(zhǔn)確的揭示香氣成分[7]。固相微萃取法（solid phase microextraction，SPME）具有操作簡(jiǎn)單、無(wú)溶劑及可減少香氣損失等特點(diǎn)，能夠快速完成采樣、萃取、富集和進(jìn)樣幾個(gè)步驟，而同時(shí)蒸餾萃取法（simultaneous distillation extraction，SDE）是通過(guò)同時(shí)加熱醬油與有機(jī)溶劑至沸騰來(lái)實(shí)現(xiàn)的，少量溶劑就可以提取大量樣品，香氣成分得到濃縮，對(duì)微量成分萃取率較高[8]。兩種萃取方法均使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀進(jìn)行分析。GC-MS技術(shù)是一種廣泛應(yīng)用于對(duì)食品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性和定量的風(fēng)味評(píng)價(jià)方法[9]。劉非等[10]選用5種固相微萃取頭分別萃取醬油揮發(fā)性成分，通過(guò)GC-MS分析，共鑒定出86種揮發(fā)性成分。馮云子[11]優(yōu)化了SDE法的萃取條件，結(jié)果顯示，有92.45%的物質(zhì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）＜20%、50.94%的化合物RSD＜10%，表明該優(yōu)化方法穩(wěn)定，有良好的重現(xiàn)性。

本試驗(yàn)應(yīng)用兩種前處理方法對(duì)同一種醬油的香氣進(jìn)行提取，并對(duì)比其成分，以期為醬油香氣的萃取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油：廣州市售；二氯甲烷（分析純）：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司；正戊烷（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)；氯化鈉（分析純）：廣東光華科技股份有限公司；無(wú)水硫酸鈉（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

6890-5973N GC-MS、毛細(xì)管色譜柱DB-WAX UI（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國(guó)Agilent科技有限公司；100 μm聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取頭：美國(guó)Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 同時(shí)蒸餾萃取法

取100 mL醬油樣品和100 mL 35%的食鹽水置于500 mL圓底燒瓶中，加入沸石，連接同時(shí)蒸餾裝置，用電熱套加熱至140 ℃左右，保持物料微沸；另將50 mL二氯甲烷加入100 mL圓底燒瓶中，55 ℃水浴，同時(shí)蒸餾萃取裝置接入冷凝水。兩側(cè)溶液出現(xiàn)回流現(xiàn)象時(shí)，開(kāi)始計(jì)時(shí)，萃取2 h，待裝置冷卻，收集溶劑部分，向萃取液中加入適量無(wú)水硫酸鈉后立即密封好瓶口，冷藏2 h以上。取出后快速過(guò)濾，濾液置于50 mL茄形瓶中，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1 mL，除去大部分二氯甲烷溶劑，然后過(guò)0.22 μm有機(jī)膜，進(jìn)行GC-MS分析。

GC-MS條件：色譜柱為DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30.0m×250 μm×0.25 μm），載氣為高純度氦氣（He）流速1.0 mL/min，不分流；電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，燈絲發(fā)射電流為0.25 mA，進(jìn)樣口溫度230 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃，離子源溫度220 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍為30～550 m/z，溶劑延遲3.8 min；起始柱溫為40 ℃并保持4 min，以6 ℃/min的速度升溫至120 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速度升溫至230 ℃，保持10 min。

運(yùn)用峰面積歸一法[12]計(jì)算各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量。

1.3.2 固相微萃取法

取8 mL醬油與攪拌子加入20 mL頂空瓶中，放入恒溫磁力攪拌器，在60 ℃條件下平衡10 min[13]，萃取頭距樣品液面0.5 cm左右，萃取45 min，在GC-MS進(jìn)樣口（230 ℃）解吸5 min。萃取頭首次使用時(shí)，在規(guī)定溫度條件下老化至無(wú)雜峰。

GC-MS條件：色譜柱等條件同方法1.3.1，檢測(cè)器溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍為30～330m/z；起始柱溫為40 ℃并保持2 min，以8 ℃/min的速度升溫到180 ℃，再以3 ℃/min的速度升溫至220 ℃，保持8 min。

2 結(jié)果與分析

分別采用同時(shí)蒸餾萃取法與固相微萃取法對(duì)醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行提取，結(jié)合GC-MS對(duì)其香氣成分進(jìn)行鑒定分析，總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1A、圖1B可知，同時(shí)蒸餾萃取的主要揮發(fā)性成分較豐富。

圖1 同時(shí)蒸餾萃取法（A）、固相微萃取法（B）提取醬油香氣成分的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of aroma components extracted from soy sauce by simultaneous distillation extraction (A) and solid-phase microextraction (B)

2.1 兩種前處理法檢測(cè)的各類(lèi)香氣物質(zhì)的比較

表1 兩種前處理法檢測(cè)到的各類(lèi)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的百分比Table 1 Percentage of various flavor substances detected by two pretreatment methods

由表1可知，兩種方法檢測(cè)出來(lái)的酸類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量占比最多，含硫類(lèi)最少。SDE法處理檢測(cè)到的呋喃類(lèi)物質(zhì)排第三占比18.16%，而SPME法處理檢測(cè)到的呋喃類(lèi)物質(zhì)排第七占比2.55%，相對(duì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于SDE法處理。SPME法檢測(cè)到其他類(lèi)，如嘧啶、吡咯與喔啉等物質(zhì)占比18.98%，而SDE法測(cè)出的其他類(lèi)占比5.38%；除了SPME法未檢測(cè)出的碳?xì)漕?lèi)，兩種方法檢測(cè)到的各類(lèi)物質(zhì)的相對(duì)含量占比排序差別不大。

2.2 兩種前處理方法檢出的各香氣物質(zhì)的比較

由表2可知，SDE法檢出的香氣物質(zhì)較豐富，有73種，SPME法檢出61種。其中有20種物質(zhì)是兩種方法共同檢出，總共檢出114種物質(zhì)。在種類(lèi)數(shù)上，固相微法萃取的酯類(lèi)與吡嗪類(lèi)相對(duì)更加豐富，但在相對(duì)含量上，SDE法檢測(cè)出的吡嗪與酯類(lèi)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SPME法檢測(cè)的。

表2 SDE-GC-MS法與SPME-GC-MS法檢測(cè)醬油中各類(lèi)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量Table 2 Relative contents of various volatile flavor substances of soy sauce detected by SDE-GC-MS and SPME-GC-MS

續(xù)表

續(xù)表

醇類(lèi)化合物香氣成分與酵母菌發(fā)酵作用存在主要的關(guān)系，醇類(lèi)物質(zhì)可經(jīng)過(guò)化學(xué)反應(yīng)后，轉(zhuǎn)換為酯類(lèi)物質(zhì)，使人感受到濃郁香氣[14]。SDE與SPME法分別檢出9種醇，其中苯乙醇、2,3-丁二醇是兩種方法共同檢出，SDE法檢出的主要為高級(jí)醇。

醬油的酸味是以乳酸、乙酸為主的有機(jī)酸類(lèi)，它們不僅是呈味成分，而且關(guān)系到醬油的香氣，也是形成酯類(lèi)物質(zhì)的重要成分[1]。兩種方法共檢測(cè)到的酸類(lèi)物質(zhì)有乙酸、丁酸、3-甲基丁酸、山梨酸，SDE法主要檢測(cè)出長(zhǎng)鏈脂肪酸，SPME法主要檢測(cè)出中鏈脂肪酸。

醛類(lèi)物質(zhì)主要來(lái)自氨基酸降解、微生物的轉(zhuǎn)化作用和油脂的氧化降解，有些醛類(lèi)物質(zhì)本身不呈味，但在復(fù)雜的醬油釀造中可與其他成分生成醬油特有的香氣成分，兩種方法共同檢出的苯乙醛具有類(lèi)似風(fēng)信子的香氣，低濃度具有水果的甜香氣。兩種方法分別檢出3種醛，共檢出4種。

酯類(lèi)物質(zhì)主要通過(guò)酵母菌對(duì)大豆油脂作用產(chǎn)生醇類(lèi)和酸類(lèi)酯化反應(yīng)得到[15]，它們具有果香并使醬油呈濃郁的酯香，而且能夠掩蓋其他化合物帶有的不良香氣[16]。SPME法檢出的酯類(lèi)相對(duì)SDE法多一些，分析可能是SDE法加熱提取過(guò)程中容易造成損失。

呈香酚類(lèi)物質(zhì)主要是曲霉在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)降解作用生成的，主要貢獻(xiàn)給醬油煙熏香和焦糖香味[17]。愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚與4-乙基苯酚是醬油中重要的酚類(lèi)物質(zhì)。兩種前處理方法均萃取出，SDE法檢測(cè)出7種，SPME法檢測(cè)出4種。

吡嗪是一類(lèi)具有堅(jiān)果香，焦香味的物質(zhì)[18]，SDE法檢測(cè)出6種，SPME法檢測(cè)出7種。

呋喃類(lèi)化合物及糠醛在微生物作用下會(huì)產(chǎn)生一定的化學(xué)反應(yīng)，使反應(yīng)物產(chǎn)生谷物香氣及咖啡香氣，雜環(huán)類(lèi)化合物的揮發(fā)性交叉[14]，SDE法檢測(cè)出8種呋喃類(lèi)物質(zhì)，而SPME法對(duì)呋喃類(lèi)化合物吸附情況較差，檢測(cè)出3種。

烯烴類(lèi)只在SDE法檢測(cè)出，其中β-蒎烯具有松節(jié)油香氣、干燥木材和松脂氣味。d-檸檬烯具有新鮮橙子及檸檬樣香氣。萜品烯具有柑橘和檸檬似香氣。

含硫化合物雖然相對(duì)含量不高，但對(duì)整體風(fēng)味有很大影響，它們來(lái)自含硫氨基酸、肽等的降解[19]，在兩種方法中均檢出的3-甲硫基丙醇低濃度時(shí)有強(qiáng)烈芬芳的肉或肉湯香氣和滋味。

其他類(lèi)物質(zhì)在極大程度上也豐富了醬油的風(fēng)味，包括吡咯、嘧啶、噻唑等，SDE法檢測(cè)出7種。SPME法檢測(cè)出6種。其中2-乙酰吡咯具有堅(jiān)果味、帶些微香豆素的香氣[20]，是兩種方法共同檢測(cè)到的物質(zhì)。

3 結(jié)論

兩種前處理方法檢出的各類(lèi)物質(zhì)的含量相對(duì)能反應(yīng)醬油中各類(lèi)物質(zhì)的占比情況，結(jié)果顯示，兩種方法檢出的酸類(lèi)相對(duì)含量最高，含硫化合物最低。但兩種方法檢出的呋喃類(lèi)與其他類(lèi)（含氮類(lèi)化合物）的差異較大，其中SDE法利于呋喃類(lèi)的萃取，而SPME法對(duì)呋喃類(lèi)的吸附較少，但是SPME法萃取出的其他類(lèi)化合物相對(duì)較多。對(duì)比兩種前處理方法，SDE可以將香氣物質(zhì)較大程度的萃取出來(lái)，但其萃取時(shí)間長(zhǎng)，且高溫蒸餾過(guò)程可能造成易揮發(fā)性物質(zhì)有所損失且容易產(chǎn)生樣品中非原有的物質(zhì)，受熱后的香氣輪廓與其原樣品的香氣輪廓相比有差異。SPME法萃取時(shí)間短，且易吸附樣品中的半揮發(fā)性、揮發(fā)性成分，整個(gè)提取過(guò)程保持在60 ℃左右的條件下進(jìn)行，無(wú)高溫影響，比較能真實(shí)地體現(xiàn)樣品的香氣成分。但對(duì)低揮發(fā)性物質(zhì)的萃取效率較低。兩種前處理方法各有優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)存在著缺點(diǎn)，為了更全面地檢測(cè)醬油中的香氣成分，還應(yīng)當(dāng)結(jié)合多種萃取及檢測(cè)方法。