算盤子提取物治療大腸桿菌性腹膜炎的機制研究

胡明燁 王長娜 武春曉 周程艷 余穎聰

大腸桿菌性腹膜炎是最常見的細菌性腹膜炎(bacterial peritonitis，BP)，是由腸道菌群紊亂位移造成的腹腔急性、感染性炎癥，出現(xiàn)腹腔感染后，腸袢及大網(wǎng)膜通過粘連局限炎癥的蔓延，如未能及時控制感染則進一步發(fā)展形成彌漫性炎癥，引發(fā)全身炎癥反應綜合征，進而導致多臟器衰竭。在其感染過程中大量激活的炎性細胞釋放多種內源性介質，包括促炎細胞因子，其中主要包括TNF-α、IL-1β、IFN-γ等，進而引發(fā)或加重腸道屏障的破壞并發(fā)生炎性反應，并導致肝臟、腎臟等重要臟器結構及功能的損害。

算盤子為大戟科植物，具有驅風、利濕、消腫散瘀、抗炎鎮(zhèn)痛等藥用功效；對痢疾、皮炎、泄瀉、急性胃腸炎等有很好的治療效果，早在《江西民間草藥》中便有算盤子抗菌治療腸炎的記錄。藥理研究發(fā)現(xiàn)，該屬植物有抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等作用[1]。本研究根據(jù)大腸桿菌性腹膜炎的誘發(fā)機制及算盤子的成分、功效、藥理作用，對算盤子進行抑菌、抗炎實驗，旨在觀察算盤子對大腸桿菌腹膜炎的治療效果并探索其作用機制，為臨床應用提供相關的依據(jù)。

材料與方法

1.實驗動物與菌株：SPF級昆明種小鼠50只，雌雄各半，4～6周齡，體質量20±2g，由北京維通利華生物技術有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2016-0002。大腸桿菌bio-00021(批號44102-3a15)、金黃色葡萄球菌bio-00002(批號26001-26)均購自北京百歐博偉生物技術有限公司。

2.試劑、材料與儀器：SOD試劑盒、MDA試劑盒、GSH試劑盒(批號20160929)均購自南京建成生物工程研究所，IFN-γ ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒(批號均為20180104)購自江蘇酶標生物科技有限公司，CRP、MMP9、NF-κB抗體(批號均為20170428)購自北京博奧森生物技術有限公司，算盤子采自廣西壯族自治區(qū)梧州市藤縣天平鎮(zhèn)新陶村自然晾干后保存，Microm HM 325 scientific型手動輪轉式石蠟切片機購自美國Thermo Fisher Scientific公司，Synergy HT型全自動酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司。

3.算盤子提取物制備：取算盤子葉粉末加入蒸餾水圓底燒瓶回流2h，連續(xù)2次，合并2次提取液，向提取液中依次加入石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，將4次萃取液及萃取后水相旋轉蒸發(fā)至恒重，備用。

4.紙片擴散法測抑菌活性：將不同極性溶劑提取得到的恒重物配置成濃度分別為0.0170、0.0150、0.0150、0.0156、0.0147g/ml的溶液。取各溶液15μl于6mm的圓濾紙片上并烘干，后將浸過不同樣品的濾紙片分別放置在涂有大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16h后用直尺測量抑菌圈直徑，以確定樣品抑菌活性[2]。

5.倍比稀釋法測定最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)：液體倍比稀釋法測定MIC，用蒸餾水將不同提取物配置成濃度均為0.0150g/ml的溶液。取96孔板倍比稀釋后取15μl各稀釋度的樣品溶液于長有金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的培養(yǎng)皿上37℃培養(yǎng)16h。以能夠抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長的最小藥物濃度為該樣品的MIC值。

6.實驗分組、造模與給藥：將50只小鼠隨機分成正常組、模型組、小檗堿陽性組(0.0774g/ml)、乙酸乙酯提取物高、低劑量組(0.1548、0.0774g/ml)，每組10只。陽性組、高、低劑量組按照1ml/100g的藥量灌胃給藥，每日2次，連續(xù)5天，其余組按比例灌0.9%NaCl注射液。除正常組外其余各組小鼠均注射1ml濃度為1.5×106CFU/ml的大腸桿菌，每日1次，連續(xù)兩天。實驗結束后取血清于-80℃貯存?zhèn)溆茫煌瑫r將肝臟、腎臟、小腸組織保存于10%甲醛溶液中備用。

7.血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β及MDA、SOD、GSH含量檢測：取上述血清，具體按照ELISA試劑盒和酶聯(lián)試劑盒說明書，用酶標儀檢測血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β炎性因子的含量及MDA、SOD、GSH的含量。

8.組織形態(tài)學觀察：取上述肝臟、腎組織、小腸組織經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色、封片，在100倍光鏡下觀察各組織的病理形態(tài)學變化。

9.小腸組織中NF-κB、MMP-9、CRP蛋白表達水平的檢測：運用免疫組化SP法進行檢測。將上述切片烤片、脫蠟、修復抗原，分別滴加NF-κB、MMP-9、CRP一抗(1∶200)，孵育、顯色，蘇木精復染，脫水透明，封片。用Image Pro Plus 6.0軟件測定鏡下陽性染色部位的累積吸光度(A)，以表示蛋白表達水平。

結 果

1.濾紙片法測抑菌活性：培養(yǎng)16h后通過直接觀察菌落生長及測量抑菌圈直徑(圖1、表1)可知，算盤子提取物對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌有抑制效果，但不同極性萃取物的抑菌效果有明顯差距。其對大腸桿菌抑菌效果依次為乙酸乙酯層、正丁醇層、二氯甲烷層，石油醚層和蒸餾水層無明顯抑菌效果；對金黃色葡萄球菌效果依次為乙酸乙酯層、正丁醇層、二氯甲烷層、蒸餾水層，石油醚層無明顯抑菌效果。

圖1 提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果A.石油醚層;B.二氯甲烷層;C.乙酸乙酯層;D.正丁醇層;E.蒸餾水層

表1 不同萃取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑

2.倍比稀釋法測定MIC：96孔細胞培養(yǎng)板倍比稀釋測得MIC值，乙酸乙酯層、正丁醇層、二氯甲烷層對金黃色葡萄球菌的MIC分別為1.88、7.50、15.00mg/ml;對大腸桿菌的MIC分別為1.88、7.50、15.00mg/ml,詳見表2。

表2 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌最低抑菌濃度

濃度1代表藥液的原始濃度(乙酸乙酯為0.015g/ml、正丁醇為0.015g/ml、二氯甲烷為0.015g/ml)，其余濃度隨序號增加二倍遞減；-.無菌生長；+.菌體較少；++.菌體較多

3.算盤子乙酸乙酯提取物對小鼠血清中MDA、SOD、GSH含量水平的影響：與正常組比較，模型組SOD、GSH水平顯著降低(t=12.907，P<0.01；t=14.051，P<0.01)，MDA水平顯著升高(t=-14.406，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義，表明造模成功。與模型組比較，陽性組SOD、GSH水平明顯升高(t=-4.914，P<0.05；t=-9.161，P<0.05)，MDA水平顯著下降(t=7.060，P<0.01)。與模型組比較，高、低劑量組SOD水平明顯升高(t=-7.688，P<0.01；t=-3.528，P<0.05)，GSH水平明顯升高(t=-8.285，P<0.05；t=-5.415，P<0.01)，MDA水平顯著下降(t=12.959，P<0.01；t=-4.573，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，詳見表3。

4.乙酸乙酯提取物對小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表達含量的影響：與正常組比較，模型組TNF-α、 IL-1β水平顯著升高(t=-12.487，

表3 算盤子乙酸乙酯提取物對小鼠血清中MDA、SOD、GSH含量的影響

與正常組比較，*P<0．01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0．01

P<0.01；t=-14.136，P<0.01)，IFN-γ水平顯著降低(t=9.869，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義，表明造模成功。與模型組比較，陽性組TNF-α、IL-1β水平顯著降低(t=8.827，P<0.01；t=7.633，P<0.01)，IFN-γ水平顯著提高(t=-6.449，P<0.01)，與模型組比較，高、低劑量組TNF-α水平顯著降低(t=7.677，P<0.01；t=4.534，P<0.05)，IL-1β水平顯著降低(t=9.369，P<0.05；t=4.813，P<0.05)，IFN-γ水平顯著提高(t=-6.848，P<0.05；t=-5.366，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，詳見表4。

表4 算盤子提取物對小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β表達的影響

與正常組比較，*P<0．01；與模型組比較，#P<0．05，##P<0．01

5.小腸、肝臟、腎組織病理結果：光鏡下可見，正常組小鼠腸黏膜完整，絨毛排列整齊。模型組腸黏膜厚度增加，細胞排列紊亂，腸絨毛形狀改變及破壞，出現(xiàn)明顯的炎性細胞浸潤。高劑量組腸黏膜紊亂及炎性細胞浸潤明顯改善，陽性組與低劑量組得到不同程度的改善。正常組小鼠肝竇排列整齊，模型組有明顯的肝竇充血，肝竇細胞紊亂，出現(xiàn)廣泛的炎性細胞浸潤。高劑量組肝竇細胞較為整齊，盡有少量炎性細胞浸潤現(xiàn)象，陽性組與低劑量組有輕微的改善。正常組小鼠腎小球結構完整，形狀規(guī)則。模型組腎小球出現(xiàn)結構破壞及明顯萎縮。高劑量組與陽性組腎小球結構完整，萎縮程度較輕。低劑量組腎小球結構出現(xiàn)輕度破壞及萎縮。通過上述可知，大腸桿菌腹腔感染可對小鼠小腸、肝臟、腎組織造成損傷，算盤子具有保護、修復組織損傷的作用，詳見圖2。

6.乙酸乙酯提取物對小鼠小腸組織局部NF-κB、MMP-9、CRP蛋白表達水平的影響：與正常組比較，模型組NF-κB、MMP-9、CRP蛋白陽性表達顯著提高(t=-22.008，P<0.01；t=-19.273，P<0.01；t=-15.194，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。與模型組比較，陽性組NF-κB、MMP-9、CRP蛋白陽性表達顯著降低(t=13.538，P<0.05；t=6.021，P<0.05；t=7.778，P<0.05)，與模型組比較，高、低劑量組NF-κB表達顯著降低(t=16.132，P<0.01；t=4.365，P<0.05)，MMP-9表達顯著降低(t=14.862，P<0.01；t=5.033，P<0.05)，CRP表達顯著降低(t=13.203，P<0.01；t=5.847，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，詳見表5、圖3。

表5 小鼠小腸組織中NF-κB、MMP-9、CRP累積吸光度

與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

討 論

大腸桿菌性腹膜炎是臨床常見的感染性炎癥，其主要由腸道菌群移位誘發(fā)機體發(fā)生炎癥，生成大量自由基，誘發(fā)氧化應激反應，使對活性氧簇ROS清除能力下降，并導致腸道功能紊亂[3]。如感染未能控制可加重腸道黏膜的破壞和功能紊亂，并損傷周邊組織器官，促發(fā)全身炎癥反應綜合征。天然藥物算盤子含有黃酮類物質、沒食子酸及槲皮素等抗菌抗炎成分[4]。本研究根據(jù)臨床疾病常見病原菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對算盤子進行不同極性組分的抑菌實驗，模擬藥物在體內的抑菌作用。結果顯示算盤子的乙酸乙酯提取物能夠相對更有效地抑制菌群生長，故取乙酸乙酯提取物進一步實驗。

圖2 各組小鼠小腸、肝臟、腎組織切片HE染色圖(×100)A.正常組;B.模型組;C.陽性組;D.高劑量組;E.低劑量組；Ⅰ.小腸組織;Ⅱ.肝臟組織；Ⅲ.腎組織

圖3 小鼠腸組織中NF-κB、MMP-9、CRP的表達水平(HE,×100)A.正常組；B.模型組；C.陽性組；D.高劑量組；E.低劑量組；Ⅰ.NF-κB；Ⅱ.MMP-9；Ⅲ.CRP

通過小鼠腹腔注射大腸桿菌模擬疾病模型進行算盤子乙酸乙酯提取物體內抗炎實驗。結果顯示，腹腔注射大腸桿菌能夠引起小鼠腹腔細菌性感染及腸道黏膜損傷，產(chǎn)生炎性反應，生成大量自由基導致氧化應激反應，同時對肝臟、腎臟重要器官也會造成影響。主要炎性因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ是由單核-吞噬細胞、T細胞等分泌的具有廣泛生物學活性的細胞因子。其中TNF-α具有多種免疫調節(jié)作用，可以介導多種炎性因子釋放，參與感染和組織修復等多種病理生理過程[5]。IL-1β是由巨噬細胞表達和分泌的炎性細胞因子，能促進其他細胞因子的表達，引起炎性反應和組織損傷[6]。IFN-γ作為一種重要的促炎因子，可引起腸黏膜屏障損傷[7]。MMP-9是由炎性細胞分泌的重要的蛋白水解酶，其表達與細胞炎癥密切相關。CRP是非特異性反應中最主要、最敏感的標志物之一，具有激活補體、促進吞噬細胞的活性、刺激單核細胞表面的組織因子表達的功能，其水平與炎性反應及組織損傷密切相關[8]。組織病理切片顯示感染后出現(xiàn)腸道炎癥的發(fā)生和對黏膜的破壞，并對腹腔重要器官肝臟、腎臟產(chǎn)生炎性損傷。

氧化應激狀態(tài)也是組織損傷的主要原因，SOD水平的高低反映內源性氧自由基清除系統(tǒng)的強弱[9]。MDA是脂質過氧化反應的最終產(chǎn)物，是組織細胞損傷的重要標志[10]。GSH 作為細胞內一種重要的調節(jié)代謝劑和抗氧化劑，具有清除氧自由基、增強抗氧化物酶活性、提高抗氧化防御能力[11]。NF-κB是一種調控因子，可同時參與氧化應激、炎性反應，其活化后可導致多種細胞因子如TNF-α、IL-1β的表達增強，從而使炎性反應加劇[12]。實驗結果顯示算盤子乙酸乙酯提取物治療后小鼠血清中SOD、GSH與IFN-γ的含量明顯升高，而MDA、TNF-α及IL-1β的含量下降，腸組織NF-κB、CRP、MMP-9蛋白的表達顯著降低，且具有劑量依賴性。提示當大腸桿菌腹腔感染發(fā)生后產(chǎn)生炎性反應和氧化應激反應，使TNF-α、IL-1β含量升高，IFN-γ含量降低，誘導NF-κB、MMP-9、CRP蛋白的表達，進一步導致組織損傷。算盤子乙酸乙酯提取物能有效地調控炎性因子及氧自由基的含量，使SOD、MDA、GSH三者維持正常水平[13]。同時抑制NF-κB、CRP、MMP-9等蛋白的表達，減輕腸道過度炎性反應及組織器官的氧化應激作用，有效地抑制瀑布式炎性反應，從而達到抗炎、抗氧化應激的作用。

綜上所述，算盤子乙酸乙酯提取物對大腸桿菌性腹膜炎具有一定的治療效果，其作用機制可能是通過抑菌、抗炎、抗氧化應激作用實現(xiàn)的。