菌根真菌對酸鋁脅迫的響應

王艷陽, 常順利,*, 王詩慧, 古麗哈娜提·波拉提別克, 張毓濤

菌根真菌對酸鋁脅迫的響應

王艷陽1, 常順利1,*, 王詩慧1, 古麗哈娜提·波拉提別克1, 張毓濤2

1. 新疆大學資源與環境科學學院綠洲生態教育部重點實驗室, 新疆烏魯木齊市 830046; 2. 新疆林科院森林生態研究所, 新疆烏魯木齊市 830063

酸性環境中活性鋁濃度升高可能抑制菌根真菌生長, 為探討酸性條件下菌根真菌對活性鋁的響應機制,以擬青霉(sp.,)、細長孢霉()、木霉菌(spp.,)、瓶頭霉()和葡萄狀穗霉()5種菌根真菌為供試材料, 采用PDA液體培養基單種純培養以pH值為5.5設定3個Al3+濃度梯度, 分別為對照(0 mmol·L-1)、低鋁(0.2 mmol·L-1)和高鋁(1.0 mmol·L-1), 研究酸性條件下不同活性鋁濃度對菌根真菌的生物量、有機酸分泌以及N、P、K含量等的影響。結果表明: (1)除擬青霉()外, 其他菌株均不同程度受活性鋁濃度影響,生物量隨活性鋁濃度增加而增加, 低鋁時比對照增加了238%(<0.05), 而細長孢霉()木霉菌()瓶頭霉()和葡萄狀穗霉()生物量均降低, 其中,和分別比對照降低了38.1%和72.5%(<0.05)。(2)5種菌根真菌分泌有機酸存在顯著性差異,和的H+分泌量在高鋁濃度時均低于對照, 對產生顯著性差異(<0.05); 僅分泌草酸, 對照的分泌量是高鋁時的1.12倍。(3)5種菌根真菌N、P、K含量隨不同活性鋁濃度脅迫存在顯著性差異,和的P、K含量隨活性鋁濃度增加而顯著增加(<0.05);和的N含量隨活性鋁濃度增加而顯著降低(<0.05),的P、K含量分別在低鋁和高鋁時達到峰值,和的N、P、K含量在低鋁時達到峰值而在高鋁時受到抑制。(4)、和受酸鋁影響不顯著, 屬耐酸鋁型菌株,和屬酸鋁敏感型菌株。本工作可為天山雪嶺云杉森林更新與幼苗存活問題研究的深入開展提供基礎依據。

菌根真菌; 活性鋁; 酸度; 有機酸; 云杉森林

0 前言

當土壤pH值小于5.5時, 土壤內部分固態的礦物鋁被活化成可溶性鋁, 可溶性鋁(主要是Al3+)抑制大部分菌根真菌釋放拮抗鋁毒物質, 導致大多數菌根真菌對植物以及林木的侵染力下降[1]。植物體內細胞核和核仁遭到嚴重破壞, 直接或間接地抑制細胞中DNA和染色體的復制及合成, 核酸代謝失調, 植物對養分的吸收能力下降, 抑制植物生長速率, 產生毒害[2]。酸性土壤中的活性鋁可能是影響林木生長的重要限制因子[3-4]。因此研究酸鋁脅迫對菌根真菌(Mycorrhizal fungi )的影響顯得尤為重要。

菌根真菌是天山雪嶺云杉()森林生態系統的重要組成部分, 是維持森林生物多樣性和生態系統功能的主要因素[5]。菌根真菌可通過兩種方式降低有毒物質的活性: (1)直接和間接途徑參與植物生理代謝, 進而介導植物抗逆性、分解有毒物質和修復退化土壤與生境[6]; (2)還可通過將鋁固定在球蛋白結構中進行鋁分隔, 分泌某些有機酸來抵抗鋁毒, 進而免受鋁等多種有毒元素引起的脅迫[7-8]。研究表明接種菌根真菌可提高寄主植物的營養及吸水能力[9-10]。研究表明酸鋁條件下菌根真菌715等可增強林木的抗鋁性[11]。因此, 選擇適應性強的菌根真菌, 培育菌根苗可大幅度提高雪嶺云杉造林成活率[12]。

雪嶺云杉是天山森林群落的單優樹種, 在干旱區涵養水源、保護生物多樣性、水土保持以及凈化大氣等方面起重要作用[13-14]。林下土壤呈酸性(灰褐色森林土, pH值為5.6左右)[15], 會存在幼苗存活困難等更新障礙問題[16]。酸性土壤中活性鋁脅迫對菌根真菌生長的抑制可能是導致雪嶺云杉幼苗存活困難的關鍵因素[17-19], 然而其作用機制尚不清楚。

本研究選取了從天山雪嶺云杉根部分離并通過一代測序技術鑒定得到的擬青霉(sp.,)、細長孢霉(,)、木霉菌(spp.,)、瓶頭霉(,)和葡萄狀穗霉(,)的5種菌根真菌[20-22]為供試材料, 通過研究酸性條件下不同活性鋁濃度對5種菌根真菌生長的影響, 期望闡述液體純培養條件下菌根真菌抗酸鋁性與其生物量、有機酸分泌、營養養分吸收之間的關系, 以期篩選出抗酸鋁型菌株, 為解決天山雪嶺云杉幼苗存活率低下等更新障礙問題提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本文從天山雪嶺云杉根部分離篩選并通過一代測序技術鑒定得到的擬青霉()、細長孢霉()、木霉菌()、瓶頭霉()和葡萄狀穗霉()5種共生菌根真菌菌株。

1.2 試驗設計

本試驗測得天山雪嶺云杉活性鋁濃度為(0.05- 0.85 g·kg–1)、pH值為5.6。

取4 ℃保存1—2個月的上述菌株, 接種于PDA液體培養基上, 在25 ℃條件下暗培養14 d備用。用分析純Al2( SO4)3·18H2O提供活性鋁, 在pH值為5.5條件下設定3個Al3+濃度的PDA液體培養基[23]: 對照(CK, 0 mmol·L–1)、低鋁(Low Al, 0.2 mmol·L–1)、高鋁(High Al, 1.0 mmol·L–1)。各處理3次重復。取150 mL三角瓶分裝不同活性鋁濃度的液體培養基, 每瓶20 mL, 封口后于121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。冷卻后接種5種菌根真菌1個直徑為6 mm的供試瓊脂菌種, 25 ℃的黑暗條件下靜置培養14 d待測。

1.3 測試指標與方法

培養結束后, 過濾收集菌絲和濾液。菌絲用于測定生物量和氮(N)、磷(P)、鉀(K)含量。菌絲生物量通過稱重法獲得。烘干的菌絲體經硫酸和雙氧水消化后, 采用凱氏定氮法測定氮含量, 鉬銻抗分光光度計法測定磷含量, 火焰光度法測定鉀含量。濾液用于測定H+分泌量與有機酸的種類、含量。H+分泌量采用pH計法測定。濾液再經定容, 過濾(0.22 μm微孔濾膜)后, 用外標法于高效液相色譜儀上分析不同有機酸的含量[24-25]。檢測的有機酸包括草酸、檸檬酸、蘋果酸、丁二酸、甲酸和乙酸。

1.4 數據處理與分析

試驗數據采用Excel進行基本計算, SPSS14.0統計軟件進行統計分析, 采用LSD(Least—Significant Difference)法對數據進行多重比較, 顯著水平<0.05。

2 結果與分析

2.1 活性鋁脅迫對受試菌株生物量的影響

活性鋁脅迫對受試菌株生物量的影響顯示(圖1), 0.2 mmol·L–1Al3+(低鋁)濃度培養液中, 僅的生物量比對照增加了238%, 顯著高于對照(<0.05);和菌絲生物量均減少, 但和差異未達到顯著水平,比對照(無鋁)減少了78.0%, 顯著低于對照(<0.05)。1.0 mmol·L–1Al3+(高鋁)濃度培養液中, 大部分菌株菌絲生物量開始下降(除和); 其中和分別比對照降低了38.1%和72.5%(<0.05);和差異未達到顯著水平;比對照增加了138%。

2.2 活性鋁脅迫對受試菌株氮磷鉀含量的影響

2.2.1 活性鋁脅迫對受試菌株氮含量的影響

活性鋁對受試菌株含氮量的影響顯示(表1), 受酸性條件不同活性鋁濃度脅迫后,和的含氮量隨活性鋁濃度增加而增加。1.0 mmol·L–1Al3+濃度處理后, 含氮量分別比對照增加了23.3%和35.8%, 但并未引起和的含氮量呈現顯著性差異。和的含氮量隨活性鋁濃度上升而降低, 均在對照時達到峰值, 分別比對照減少了34.9%和46.5%, 顯著低于對照(<0.05)。隨培養液活性鋁濃度的變化趨勢是先上升后下降, 0.2 mmol·L–1Al3+濃度時的含氮量達到峰值, 比對照增加了109%, 顯著高于對照(<0.05), 1.0 mmol·L–1Al3+濃度處理后, 含氮量有所下降, 但活性鋁濃度并未引起其顯著變化。

注: 不同小寫字母表示同一菌株在不同活性鋁濃度條件下差異顯著(P<0.05)。

Figure 1 Biomass of five fungi under different aluminum treat-ments

表1 活性鋁脅迫對受試菌株氮含量的影響/(mg·g–1干重)

注: 不同小寫字母表示相同菌株不同活性鋁濃度處理的平均值0.05水平差異顯著。

2.2.2 活性鋁脅迫對受試菌株磷含量的影響

活性鋁對受試菌株含磷量的影響顯示(表2), 受不同活性鋁濃度脅迫后,和的含磷量隨培養液活性鋁濃度增加而增加, 1.0 mmol·L–1Al3+濃度處理后, 含磷量分別比對照增加了23.3%和30.9%, 顯著高于對照(<0.05)。和的含磷量隨活性鋁濃度變化是先上升后降低, 均在0.2 mmol·L–1Al3+濃度處理時達到峰值, 分別比對照增加了66.0%和17.7%, 顯著高于對照(<0.05), 1.0 mmol·L–1Al3+濃度處理后, 并未對其產生顯著性差異。隨培養液活性鋁濃度的變化趨勢是先降低后升高, 1.0 mmol·L–1Al3+濃度時達到最大值, 比對照增加了9.8%, 差異不顯著。

表2 活性鋁脅迫對受試菌株磷含量的影響/(mg·g–1干重)

注: 不同小寫字母表示相同菌株不同活性鋁濃度處理的平均值0.05水平差異顯著。

2.2.3 活性鋁脅迫對受試菌株鉀含量的影響

活性鋁對受試菌株含鉀量的影響顯示(表3), 0.2 mmol·L–1Al3+濃度處理時,、和與對照無顯著差異。和分別比對照增加了23.7%、5.4%和2.7%;和分別比對照減少了13.6%和10.1%。1.0 mmol·L–1Al3+濃度處理后, 僅的含鉀量隨培養液活性鋁濃度增加而增加, 比對照增加了25.9%, 顯著高于對照(<0.05);和的含鉀量均與活性鋁濃度無顯著性差異,和分別比對照減少了3.7%和8.9%,和分別比對照增加了0.4%和12.2%。

2.3 活性鋁對受試菌株有機酸分泌量的影響

2.3.1 H+分泌量

活性鋁脅迫對受試菌株H+分泌量的影響顯示(圖2),的H+分泌量與活性鋁濃度呈現先降低后增加的趨勢。對照達到最大值, 低鋁處理達到最低值, 高鋁處理時, 比對照減少了58.3%, 顯著低于對照(<0.05);和H+分泌量與活性鋁濃度的關系則呈現先上升后降低的趨勢, 均在低鋁時達到最高值, 分別比對照增加了1.5%(顯著高于對照< 0.05)、43.3%和220%(顯著高于對照<0.05), 活性鋁脅迫對和均產生了顯著性差異, 并未對產生顯著性差異;的H+分泌量隨活性鋁濃度增加而增加, 在高鋁濃度下比對照增加了207%, 但酸鋁脅迫并未對產生顯著性差異。

表3 活性鋁脅迫對受試菌株鉀含量的影響/(mg·g–1干重)

注: 不同小寫字母表示相同菌株不同活性鋁濃度處理的平均值0.05水平差異顯著。

注: 不同小寫字母表示同一菌株在不同活性鋁濃度條件下差異顯著(P<0.05)

Figure 2 H+secretion of 5 fungi treated with different active Aluminum concentrations

2.3.2 有機酸分泌量

本試驗在菌根真菌培養液中檢測出草酸、檸檬酸、蘋果酸、丁二酸、乙酸。不同活性鋁濃度梯度對5種菌根真菌有機酸分泌量的影響顯示(表4)。所有供試菌株均檢測出蘋果酸,和蘋果酸分泌量無論在對照、低鋁、高鋁均未出現明顯差異,和均在低鋁時達到峰值, 高鋁時分別比對照減少了27.1%和40.9%。僅分泌草酸, 并隨活性鋁濃度增加而減少, 對照的分泌量是高鋁時的1.12倍。供試菌株中檸檬酸分泌除外,和均被檢測出, 高鋁時分別比對照增加了48.8%、189%、29.9%和227%, 其中和均在高鋁時達到峰值,在對照處理時有少量檸檬酸分泌。和均分泌丁二酸,在對照處理時達到峰值, 而在低鋁時達到峰值,和未分泌。所有供試菌株均未檢測到甲酸。5種供試菌株中, 只有分泌大量乙酸, 并且在低鋁時達到峰值, 高鋁時開始下降。

3 討論

3.1 活性鋁對受試菌株生物量的影響

在活性鋁脅迫條件下, 菌絲生物量是指示菌根真菌抗鋁能力的可靠指標之一[26]。線郁等[27]研究表明, 土壤中低pH值(3.8—5.5)和高鋁濃度對菌根真菌的生長存在不同程度的影響。辜夕容等[28]研究分析表明, 在鋁脅迫及pH值(4.5—5.5)條件下, 鋁對耐鋁型菌種715和04的生長無抑制作用, 卻顯著抑制敏感型菌種S238N、S238A和270的生長。本試驗中, 活性鋁脅迫對受試菌株生物量的影響顯示(圖1), 0.2 mmol·L–1Al3+濃度培養液中, 鋁脅迫對的生物量無抑制作用, 顯著增加其生物量, 甚至在1.0 mmol·L–1Al3+濃度培養液中,比對照增加了138%。這一結果與菌根真菌在活性鋁脅迫下能顯著增加菌液中菌絲生物量相似[29]。說明在這五種菌根真菌中對鋁的抗性最強。然而不同菌株對鋁的抗性是存在較大差異的。李華等[30]研究發現, Al3+可顯著降低13的生物量, 對13的抑制作用顯著大于715和04。低鋁濃度處理時,和菌絲生物量均減少, 但和差異未達到顯著水平,顯著低于對照(<0.05); 高鋁濃度處理時,和顯著低于對照(<0.05),和差異未達到顯著水平。說明受鋁脅迫作用最顯著。

表4 不同活性鋁濃度梯度對5種菌根真菌的有機酸分泌量的影響/(mmol·g–1干重)

注: 不同小寫字母表示相同菌株不同活性鋁濃度處理的平均值0.05水平差異顯著。

結合以上結論可得出:菌絲生物量受酸鋁影響不顯著, 在高鋁濃度處理下生物量仍高于對照, 表現出較強的抗鋁性;和抗鋁性次之;抗鋁性較差;抗鋁性最差。說明和具有一定的鋁吸收累積能力, 對鋁顯示出一定的耐受性。我國天山雪嶺云杉森林林下土壤pH值小于5.6(酸雨pH值), 屬于弱酸至強酸森林土壤, 活性鋁含量較高。因此, 在天山雪嶺云杉森林土壤中分離并篩選抗酸鋁型本土菌株對促進云杉幼苗有重要意義。

3.2 活性鋁對受試菌株有機酸分泌量的影響

在土壤中, 菌根真菌在鋁脅迫下可釋放低分子量的有機酸, 可與鋁形成穩定的螯合物, 阻止菌絲和根系細胞對鋁的吸收, 降低活性鋁活性, 進而緩解鋁毒害[31]。不同菌根真菌在活性鋁脅迫下分泌的有機酸具有顯著性差異。Cumming等[32]研究發現, 在活性鋁脅迫條件下, 菌根真菌不僅能分泌草酸, 還能分泌其它種類的有機酸。

本試驗5種受試菌株中, 僅的H+分泌量隨培養液活性鋁濃度的增加而增加, 其剩余4種受試菌株則與不同, 這一結果與周志峰[33]等發現有9個受試菌株的H+分泌量與培養液活性鋁濃度呈極顯著正相關不一致, 推測可能是由于不同地區導致菌根真菌的生理特性和對生態環境的適應性不同。分泌出的有機酸數量最多, 高達4種, 且乙酸含量在低鋁時達到峰值, 同時分泌能有效抵抗鋁毒害的草酸, 說明在活性鋁脅迫過程中, 活性鋁濃度已達到其生長的耐受限度, 因此分泌多種有機酸來拮抗鋁毒。分泌3種有機酸, 無草酸分泌, 說明草酸并不是其拮抗鋁毒的唯一途徑, 可能通過分泌其他有機酸來緩解鋁毒。這與研究發現對Al3+具有一定抗性的715, 其草酸分泌量低于試驗中其他菌株, 卻分泌出了大量的丁二酸, 說明分泌草酸可能不是所有菌根真菌耐鋁性強弱的唯一指標結果[34]相似。、和均只分泌2種有機酸, 可能是由于活性鋁濃度并未達到其生長耐受限度。因此, 有機酸分泌量增加有利于菌根真菌利用這些有機酸與重金屬結合以緩解菌根真菌或菌根植物的鋁毒害[35]。

3.3 活性鋁對受試菌株氮磷鉀含量的影響

研究表明, 高鋁條件下低磷有效性和土壤酸度是菌根真菌生長的主要制約因素[36]。然而在高鋁條件下, 菌根真菌對于促進植物及林木對營養養分(N、P、K)的吸收和利用率存在顯著性差異[37-38]。

本試驗中,和的N、P、K含量隨活性鋁濃度增加而增加, 顯著高于對照, 這說明在活性鋁毒害下, N、P、K含量的增加可能是其拮抗鋁毒的重要途徑, 這一結果與菌根真菌能促進氮含量的增加相似[39];和的N含量隨活性鋁濃度增加而降低, 均顯著低于對照, 說明活性鋁濃度抑制其含氮量的吸收, 使其生長受到限制,的P、K含量分別在低鋁和高鋁時達到峰值, 說明在低鋁處理時, 促進了P、K含量的吸收從而抵抗鋁脅迫, 但高鋁處理時又抑制其吸收;和的N、P、K含量在低鋁時達到峰值, 高鋁時受到抑制, 這與張薇等[40]發現715、13和00在低鋁處理時刺激其生長的研究, 反而高鋁處理時抑制其生長相似。盡管不同菌株的養分含量對活性鋁的響應有所不同, 仍能看出多數菌株表現為當適當活性鋁脅迫后N、P、K含量有所增加, 這一結果與接種菌根真菌可顯著提高菌液中N、P、K含量相似[41], 說明這可能是這些菌株用來拮抗鋁毒的重要途徑之一。

研究表明, 低磷脅迫下菌根真菌共生體系特殊的磷吸收轉運系統對于改善植物磷營養狀況可能具有重要意義[42]。菌根真菌增加P、K的吸收有利于降低Al3+的活性及促進生物代謝, 從而緩解鋁毒[43]。因此, 在鋁脅迫條件下, 菌絲體內的磷、鉀濃度增加對于菌根真菌有積極意義。

4 結論

綜上所述, 酸性環境單菌種液體培養條件下, 受試各菌株(擬青霉除外)均不同程度受活性鋁濃度抑制作用, 有機酸分泌量存在顯著性差異, 菌絲N、P、K含量也呈現顯著性差異。5種受試菌株中,、和受酸鋁影響不顯著, 屬抗酸鋁型菌株, 而和屬酸鋁敏感型菌株。因此, 篩選出抗酸鋁菌根真菌應用于天山雪嶺云杉森林中, 為天山雪嶺云杉幼苗更新提供理論依據。

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Response of mycorrhizal fungi to acid aluminum stress

WANG Yanyang1, CHANG Shunli1,*, WANG Shihui1, Gulihanati Bolatibike1, ZHANG Yutao2

1.Key Laboratory of Oasis Ecology, College of Resource and Environment Science, Xinjiang University, Urumqi 830046, China 2.Institute of Forest Ecology, Xinjiang Academy of Forestry, Urumqi 830063,China

Increased concentration of active aluminum in an acidic environment may inhibit the growth of mycorrhizal fungi. In order to further explore the response mechanism of mycorrhizal fungi to active aluminum under acidic conditions in Tianshan forest area, this paper used five mycorrhizal fungi ofsp.,,,spp.,,,and,. The test material was set up in a single pure culture of PDA liquid mediumat a pH of 5.5 to set three Al3+concentration gradient controls (CK), low Aluminum (0.2 mmol·L-1), and high Aluminum (1.0 mmol·L-1). The effects of changes in active aluminum concentration on the biomass, organic acid secretion, and N, P, and K contents of mycorrhizal fungi were studied. The results showed that: (1) Except for, other strains were inhibited by active aluminum concentration to varying degrees;biomass was positively correlated with active aluminum concentration, and low content of aluminum was increased by 238% compared with control (<0.05); the biomass of,,anddecreased, among which,anddecreased by 38.1% and 72.5%, respectively. (<0.05). (2) There were significant differences in the secretion of organic acids by five mycorrhizal fungi. Except for, the H+secretion of,,andwas lower than CK at a high content of aluminum, and there was a significant difference in(<0.05). Onlydetected oxalic acid, and the amount of oxalic acid secretion was 1.12 times higher than CK. (3) The contents of N, P and K in five mycorrhizal fungi were significantly different from the concentration of active aluminum. The contents of P and K inandwere positively correlated with the concentration of active aluminum (<0.05). The N content of,was significantly negatively correlated with the active aluminum concentration (<0.05). The P and K contents ofreached the peak at low and high content of aluminum, respectively. The N, P and K contents ofandpeaked at low content of aluminum. It was suppressed in high content of aluminum. (4),andwere not significantly affected by acid aluminum and belonged to the acid-aluminum resistance strain.andwere acid-aluminum sensitive strains.

mycorrhizal fungi; active aluminum; acidity; organic acid content; Tianshan forest area

10.14108/j.cnki.1008-8873.2020.03.005

Q945.79

A

1008-8873(2020)03-031-07

2019-01-05;

2019-06-27

國家自然科學基金項目(U1503187); ”十二五”農村領域國家科技計劃課題(2015BAD07B03-03)

王艷陽(1992—), 女, 河南駐馬店人, 碩士研究生, 主要研究方向為森林生態學, E-mail: 1491021271@qq.com

常順利, 男, 博士, 副教授, 主要研究方向為森林生態學, E-mail: ecocsl@163.com

王艷陽, 常順利, 王詩慧, 等. 菌根真菌對酸鋁脅迫的響應[J]. 生態科學, 2020, 39(3): 31–37.

WANG Yanyang, CHANG Shunli, WANG Shihui, et al. Response of mycorrhizal fungi to acid aluminum stress[J]. Ecological Science, 2020, 39(3): 31–37.