超高效液相色譜-串聯質譜檢測雞蛋、雞肉和豬肉中酰胺醇類藥物殘留

陳濤，倪建秀，陳桂芳，李文杰

(南京市農產品質量檢測院，江蘇 南京 210036)

氯霉素(chloramphenicol,CAP)、甲砜霉素(thiamphenicol,TAP)、氟苯尼考(florfenicol,FF)均屬于酰胺醇類藥物，具有廣譜抗菌性，對革蘭陽性和革蘭陰性菌都具有抑制作用，因此在畜禽養殖中常被用于預防和治療細菌感染[1-3]。然而，研究發現氯霉素對人類的造血系統有明顯的毒性作用，可引起再生障礙性貧血，甲砜霉素則會抑制紅細胞、白細胞和血小板的生成，而氟苯尼考具有胚胎毒性[4-5]。因此為了避免此類藥物在動物源性食品中的殘留給人類健康造成危害，在世界各國，該類藥物的使用都受到嚴格的限制。歐盟關于獸藥殘留的(EU)No 37/2010號法規和我國農業部235號公告都規定氯霉素為禁用藥物，甲砜霉素的最高殘留限量為50 μg/kg(蛋雞產蛋期為禁用)，氟苯尼考在雞肉中的最高殘留限量為100 μg/kg，在豬肉中為300 μg/kg(蛋雞產蛋期為禁用)。氟苯尼考胺(florfenicol amine,FFA)是氟苯尼考在動物體內代謝的主要產物[6]，因此農業部235號公告將其作為標志殘留物計算氟苯尼考殘留量，而歐盟(EU)No 37/2010號法規中氟苯尼考殘留量是以氟苯尼考胺和氟苯尼考殘留總量計。

目前該類藥物的檢測方法主要有液相色譜法[7]、液相色譜-串聯質譜法[8-10]、氣相色譜-串聯質譜法[11]、毛細管電泳法[12]、酶聯免疫法等[13]，其中液相色譜-串聯質譜法因其具有較高的靈敏度和準確性，得到廣泛應用。Xie等[14]采用乙酸乙酯∶乙腈∶氨水(49∶49∶2，V/V)混合溶液提取、正己烷去脂后進行液相色譜-串聯質譜分析，對雞蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺進行定量檢測，取得良好的回收率和精密度結果。Barreto等[9]選擇乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)作為提取溶劑，對禽肉、豬肉、牛肉和魚肉中的4種酰胺醇類藥物進行定量檢測，提取物經正己烷去脂后進行液相色譜-串聯質譜分析，結果顯示在牛肉基質中4種化合物的回收率范圍為82%～108%。

酰胺醇類藥物作為一類廉價、高效的抗生素在畜禽養殖中有著廣泛的使用，但不規范、不合理甚至非法用藥的現象時有發生，因此需要建立一種可同時檢測多種畜禽產品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留量的準確、穩定的定量檢測方法，對此類藥物在畜禽產品中的殘留進行監控。目前國內畜禽產品中酰胺醇類藥物殘留的檢測標準大多只檢測氟苯尼考原型而未檢測其代謝產物，且同時檢測禽蛋、禽肉和豬肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留量的超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)的報道較少。曾勇等[15]采用液相色譜串聯質譜法測定禽蛋和禽肉中酰胺醇類藥物殘留，未包括豬肉基質。本文使用經過優化的提取溶劑和固相萃取(SPE)步驟，進行超高效液相色譜-串聯質譜分析，最終方法檢出限可達0.1 μg/kg，為同時檢測雞蛋、雞肉和豬肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留建立了一種靈敏度高、穩定性好的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考對照品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；氟苯尼考胺對照品購自德國Witega公司；氘代氯霉素(氯霉素-d5)、氘代氟苯尼考(氟苯尼考-d3)對照品購自加拿大TRC公司；乙腈、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、丙酮為色譜純，購自美國TEDIA公司；乙酸銨、甲酸、乙酸為色譜純，購自美國Sigma-aldrich公司；試驗用水為Millipore系統所制超純水。

精密稱取上述標準品，用甲醇各自配制成100 μg/mL標準儲備液，然后精密量取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺標準儲備液適宜體積，用甲醇配制成1.0 μg/mL的混合標準工作液。同時精密量取氯霉素-d5和氟苯尼考-d3內標標準儲備液適宜體積，用甲醇配制成1.0 μg/mL的混合內標標準工作液。標準溶液均置于-20 ℃保存。

1.2 樣品處理

提取：稱取2.00 g(精確至0.01 g)試樣于 50 mL聚丙烯離心管中，加入1.0 μg/mL混合內標標準工作液10 μL,再加入乙腈∶氨水(98∶2，V/V)溶液10 mL，于渦旋混合器上混合1 mim后振蕩20 min,以4 ℃，10 000 r/min,離心5 mim,取上清液，再向沉淀中加入10 mL乙酸乙酯重復提取1次,合并2次提取上清液，40 ℃水浴中氮吹至近干，然后用5 mL丙酮∶正己烷(1∶9，V/V)溶液復溶待用。

凈化：將復溶后的提取液全部轉移至經5 mL丙酮∶正己烷(1∶9，V/V)溶液活化的CNW Si SPE柱中，擠干后用5 mL丙酮∶正己烷(6∶4，V/V)溶液洗脫，洗脫液在40 ℃水浴中氮吹至近干。用1 mL乙腈∶水(3∶7，V/V)溶液溶解，再加入2 mL正己烷，4 000 r/min,離心10 mim,取下層過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯質譜測定。

1.3 儀器條件

1.3.1 超高效液相色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC CSH C18 (100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，前端連接ACQUITY UPLC CSH保護柱(5 mm×2.1 mm，1.7 μm)。流動相A為2 mmol/L乙酸銨水溶液，流動相B為mmol/L乙酸銨乙腈溶液。梯度洗脫：0.2～6 min,5% B～60% B, 6～7 min, 60% B～95% B, 7～8 min, 維持95% B, 8～8.1 min, 95% B～5% B, 8.1～9.5 min,維持5% B,流速0.3 mL/min,進樣量5 μL，流路在1～6 min之間進入質譜，在1 min之前和6 min之后切向廢液，柱溫為40 ℃。

1.3.2 質譜條件

電噴霧離子源ESI；0～2.5 min,進行正離子模式掃描(氟苯尼考胺)，2.5～9.5 min，進行負離子模式掃描(氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素-d5、氟苯尼考-d3)，霧化氣壓力為414 kPa,氣簾氣壓力為207 kPa,輔助加熱氣壓力為345 kPa，碰撞氣設置為Medium,以上4種氣體均為氮氣，離子源溫度為600 ℃，正離子化電壓為4 500 V，負離子化電壓為-4 500 V，多反應監測(MRM)采集模式，優化后的4種化合物及2種內標物的檢測離子、對應質譜參數見表1。

表1 4種化合物及2種內標物的檢測離子、對應質譜參數

名稱母離子/(m·z-1)子離子/(m·z-1)去簇電壓/V碰撞電壓/eV氟苯尼考胺248.0230.1*12015130.012028氟苯尼考356.0336.0*-100-14185.1-100-25氯霉素321.1152.1*-85-23256.9-85-15甲砜霉素353.9289.9*-85-16184.9-85-26氟苯尼考-d3359.0188.0*-130-25氯霉素-d5326.0157.0*-120-23

注：*表示定量子離子。

2 結果與分析

2.1 檢測方法優化

2.1.1 質譜條件優化

采用針泵直接進樣方式，對50 ng/mL的氟苯尼考胺標準溶液進行正離子模式下母離子全掃描，確定其分子離子峰，同樣方式對50 ng/mL的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素-d5、氟苯尼考-d3標準溶液進行負離子模式下母離子全掃描，確定其分子離子峰，然后以這些分子離子作為母離子進行子離子全掃描，選擇其中響應水平較高且干擾較小的2個子離子分別作為定量和定性離子，最后優化其去簇電壓和碰撞電壓等質譜參數，結果詳見表1。

2.1.2 液相色譜條件優化

嘗試選擇含不同濃度乙酸銨的水和乙腈溶液作為流動相，最終發現乙酸銨為2 mmol/L時，氟苯尼考胺可以在C18柱上獲得足夠保留時間，各化合物的峰形和響應強度也較好，同時在添加基質后，目標物出峰處沒有明顯雜峰干擾(見圖1～3)，最終選擇含2 mmol/L乙酸銨的水和乙腈溶液作為流動相。

2.1.3 前處理條件優化

選擇乙腈、乙酸乙酯、乙腈∶氨水(98∶2，V/V)、乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)、乙腈∶乙酸乙酯∶氨水(49∶49 ∶2，V/V)作為提取溶劑，并比較了在不同提取溶劑間進行組合提取后的回收率，結果顯示乙腈∶氨水(98∶2，V/V)提取1次后再使用乙酸乙酯提取1次，4種化合物的添加回收率整體較好，結果詳見圖4～6。

在凈化環節，本文比較了BoundElut-C18、Oasis MCX、Oasis HLB 和CNW Si 4種SPE柱對雞蛋、雞肉和豬肉3種基質的凈化效果，最終選擇使用CNW Si小柱，其去除干擾雜質效果較好，4種化合物整體回收率較高。

2.2 線性和靈敏度

精密量取酰胺醇類標準工作液適量，用空白基質提取液稀釋成含有各化合物濃度分別為0.2、1.0、5、10、20、50、100 ng/mL的混合標準工作液(氟苯尼考-d3、氯霉素-d5內標濃度為10 ng/mL)，依次進樣，將測得的峰面積比值與對應濃度比值擬合，繪制標準曲線，結果表明在0.2～100 ng/mL范圍內，各化合物在不同基質中標準曲線的線性良好，相關系數均大于0.99，結果見表2。

向空白試樣中逐級添加4種化合物，以獲得的各目標化合物的定量離子峰信噪比≥3時的最低添加濃度為該化合物的方法檢測限，以信噪比≥10時的最低添加濃度為該化合物的方法定量限。結果表明，在雞蛋、雞肉和豬肉中，酰胺醇類4種化合物的檢測限為0.1 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。

2.3 回收率和精密度

向空白試樣中添加0.5、1.0、2.0 μg/kg的3個不同濃度的混合標準工作液，每個濃度6個平行，按照1.2方法進行添加回收試驗，重復進行3次，空白基質樣品和空白基質添加樣品色譜圖見圖7及圖1-3。結果顯示，本方法在0.5～2.0 μg/kg添加范圍內，回收率范圍為70.6%～112.3%，批內相對標準偏差為1.5%～12.7%，批間相對標準偏差為3.2%～14.5%，結果見表3。

A. 空白雞蛋基質中添加2.0 μg/kg的4種化合物和5.0 μg/kg的2種內標物總離子流；B.氟苯尼考胺；C.甲砜霉素；D.氟苯尼考；E.氯霉素；F.氟苯尼考-d3；G.氯霉素-d5

圖1 空白雞蛋基質中添加酰胺醇類藥物色譜

A.空白雞肉基質中添加2.0 μg/kg的4種化合物和5.0 μg/kg的2種內標物總離子流；B.氟苯尼考胺；C.甲砜霉素；D.氟苯尼考；E.氯霉素；F.氟苯尼考-d3；G.氯霉素-d5

圖2 空白雞肉基質中添加酰胺醇類藥物色譜

A.空白豬肉基質中添加2.0 μg/kg的4種化合物和5.0 μg/kg的2種內標物總離子流；B.氟苯尼考胺；C.甲砜霉素；D.氟苯尼考；E.氯霉素；F.氟苯尼考-d3；G.氯霉素-d5

圖3 空白豬肉基質中添加酰胺醇類藥物色譜

圖4 雞蛋中4種化合物不同提取條件下回收率

圖5 雞肉中4種化合物不同提取條件下回收率

圖6 豬肉中4種化合物不同提取條件下回收率

2.4 基質效應

向空白試樣提取液中添加適量混合標準工作液制成5 μg/kg的基質加標溶液，與同濃度溶劑加標溶液進行比較，設置3個平行，每個平行重復進樣2次，記錄目標化合物峰面積。試驗結果表明在不同基質中氟苯尼考胺等4種化合物和氟苯尼考-d3等2種內標物都表現出一定程度的基質效應，其中氟苯尼考胺和甲砜霉素在3種基質中表現出的基質效應較弱，而氟苯尼考和氯霉素在3種基質中則有明顯的基質增強效應，同時作為內標物的氟苯尼考-d3和氯霉素-d5除在雞蛋中基質效應不顯著外，在另外2種基質中則有明顯基質增強效應存在,具體結果見表4。

2.5 實測樣品

對從南京地區部分養殖場、屠宰場抽取的雞蛋、雞肉和豬肉樣品各10份進行檢測，并同時由質控人員向3種空白基質中隨機添加4種化合物進行盲樣添加試驗，最終30份樣品中未檢出氟苯尼考等4種藥物， 1份雞肉盲樣中檢出氯霉素0.48 μg/kg(添加量為0.5 μg/kg)，1份雞蛋盲樣中檢出氟苯尼考1.56 μg/kg(添加量為1.5 μg/kg)，盲樣檢測回收率與2.3添加回收試驗結果相符合，說明該方法適用于雞蛋、雞肉和豬肉中酰胺醇類藥物檢測。

表2 空白基質匹配標準曲線方程、線性范圍及相關系數

空白基質化合物名稱標準曲線方程線性范圍/(μg?L-1)相關系數/r雞蛋氟苯尼考胺y=0.341 05x+0.003 110.2～1000.995 5氟苯尼考y=0.837 18x+0.004 820.2～1000.995 8氯霉素y=0.745 92x+0.004 800.2～1000.998 7甲砜霉素y=0.219 81x+0.000 170.2～1000.996 8雞肉氟苯尼考胺y=0.396 35x+0.016 720.2～1000.992 9氟苯尼考y=1.166 08x+0.002 290.2～1000.996 5氯霉素y=0.776 11x+0.001 080.2～1000.997 9甲砜霉素y=0.175 74x+0.011 390.2～1000.995 2豬肉氟苯尼考胺y=0.480 42x+0.002 730.2～1000.996 4氟苯尼考y=0.877 19x+0.005 610.2～1000.995 7氯霉素y=0.817 61x+0.004 730.2～1000.996 7甲砜霉素y=0.182 17x+0.001 280.2～1000.996 6

表3 空白基質中添加4種化合物回收率及精密度

空白基質化合物名稱添加濃度/(μg?kg-1)回收率/%批內RSD(n=6)/%批間RSD(n=3)/%氟苯尼考胺0.570.69.89.81.072.88.57.92.073.46.35.2氟苯尼考0.598.712.76.81.0107.27.110.4雞蛋2.0101.52.68.9氯霉素0.5108.54.312.41.0105.69.27.62.0110.411.311.5甲砜霉素0.574.51.510.91.078.52.74.82.083.91.83.6氟苯尼考胺0.575.45.36.41.079.27.211.22.076.68.58.7氟苯尼考0.5105.73.35.61.0112.33.64.9雞肉2.0109.64.03.2氯霉素0.5108.33.912.61.096.75.37.52.098.94.14.7甲砜霉素0.594.29.213.11.095.35.310.42.094.76.46.9氟苯尼考胺0.580.57.94.71.086.78.810.82.084.910.67.6氟苯尼考0.5103.15.33.31.0107.53.44.8豬肉2.0108.46.24.5氯霉素0.592.69.86.11.0105.45.712.82.0110.72.511.3甲砜霉素0.580.68.714.51.085.85.210.32.087.16.68.4

表4 不同基質中4種化合物及2種內標物基質效應

化合物名稱雞蛋雞肉豬肉氟苯尼考胺1.041.031.04氟苯尼考1.301.521.51甲砜霉素1.061.091.03氯霉素1.251.811.75氟苯尼考-d30.941.531.60氯霉素-d51.111.281.45

3 討論

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素-d5和氟苯尼考-d3的化學結構中含有鹵素原子和羥基基團，具有高電負性，在質譜負離子掃描模式下獲得的靈敏度較高，氟苯尼考胺的化學結構中含有氨基基團，在正離子模式下靈敏度較高[14]。因此在一次進樣中要同時進行正、負兩種離子模式的質譜掃描，此時流動相的選擇對不同目標物的峰形和響應強度有著重要影響。在流動相中添加甲酸或乙酸，可以提高正離子模式掃描下的氟苯尼考胺的響應強度，改善其峰形，但是對采用負離子模式掃描的其他5種化合物則會產生離子抑制效應[16]。選擇不添加任何物質的水和乙腈作為流動相，可以在正、負兩種離子掃描模式下獲得較好的響應強度，但此時極性相對較強的氟苯尼考胺在C18柱上保留則會較弱，系統死體積內就會被洗脫下來。本文最終選擇含2 mmol/L乙酸銨的水和乙腈溶液作為流動相，使各化合物能夠獲得良好色譜分離和響應強度。

乙腈或乙酸乙酯對氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的提取效率較高[14-19]。但由于氟苯尼考胺是一種弱堿性物質，堿性環境中會更利于其在液液萃取中分配于有機相中，因此在選擇提取溶劑時，需要考慮性質不同的所有目標化合物的提取效率。本文最終選擇乙腈∶氨水(98∶2，V/V)提取1次后再使用乙酸乙酯提取1次，4種化合物的添加回收率整體較好。但乙酸乙酯作為提取溶劑，其對包括脂肪在內的非極性化合物有較高的選擇提取性，因此需要增加正己烷去脂的步驟，可以更好的去除磷脂等脂類共提取物，進一步降低基質干擾。同時加入正己烷后的復溶樣品應避免劇烈振蕩，否則易產生乳化現象，造成目標化合物的損失，影響回收率。

A.雞蛋；B.雞肉；C.豬肉

圖7 空白基質樣品總離子流色譜

基質效應(matrix effect，ME)=基質加標溶液峰面積/溶劑加標溶液峰面積，若比值大于1，說明存在基質增強效應；若小于1，則說明存在基質抑制效應；若等于1，表明不存在基質效應。基質效應對目標物定量準確性的影響可通過內標法進行一定程度的校正，同時選擇基質匹配的標準曲線，有助于提高定量檢測的準確性。

本文建立了雞蛋、雞肉和豬肉中酰胺醇類藥物及其代謝物殘留的UPLC-MS/MS檢測方法，通過對色譜、質譜條件和樣品前處理方法的優化改進，使該方法具有較高靈敏度，良好穩定性，能滿足同時檢測畜禽產品中多種酰胺醇類藥物殘留的分析要求，可用于雞蛋、雞肉和豬肉中酰胺醇類藥物檢測，為制定相關檢測技術標準提供了技術參考。