PI3K/Akt信號通路相關蛋白在膽管癌中的表達及其臨床意義

黃利勇 吳芳華 鄭志剛

【摘要】 目的：探討PI3K/Akt信號通路相關蛋白PI3K、Akt、PTEN在膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）中的表達及其臨床意義。方法：收集2010年1月-2017年1月本院47例CCA患者的癌組織及對應癌旁組織標本，另選擇同期14例正常膽管組織標本。比較CCA、癌旁組織及正常膽管組織中PI3K、Akt與PTEN蛋白的陽性表達率，并分析PI3K、Akt與PTEN蛋白在CCA組織中陽性表達的相關因素及相關性。結果：CCA組織中PI3K與Akt的陽性表達率均高于癌旁組織和正常膽管組織（P<0.05）;CCA組織中PTEN陽性表達率均低于癌旁組織和正常膽管組織（P<0.05）;CCA組織、癌旁組織及正常膽管組織的PI3K、Akt及PTEN陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。有無神經侵犯、浸潤深度、淋巴結轉移情況及TNM分期是PI3K、Akt及PTEN蛋白在CCA組織中陽性表達的相關因素（P<0.05）。PI3K、Akt與PTEN在CCA組織中的表達呈負相關（r=-0.635、-0.506，P<0.001），而PI3K與Akt在CCA組織中的表達呈正相關（r=0.332，P=0.023）。結論：PI3K/Akt信號傳導通路在CCA組織中過度表達，可能參與了CCA的發生與發展，可作為生物學行為的評估指標，PI3K/Akt信號通路可望成為CCA臨床干預的分子靶點。

【關鍵詞】 膽管癌 PI3K/Akt信號通路 PTEN

[Abstract] Objective： To investigate the expression and clinical significance of protein PI3K， Akt and PTEN which correlated with PI3K/Akt signaling pathway in cholangiocarcinoma （CCA）. Method： Cancer tissues and corresponding paracancer tissue specimens of 47 CCA patients were collected from our hospital from January 2010 to January 2017. Another 14 normal bile duct specimens were selected. The positive expression rates of PI3K， Akt and PTEN proteins in CCA， paracancer and normal bile duct tissues were compared， and the relevant factors and correlations of PI3K， Akt and PTEN proteins expressions in CCA tissues were analyzed. Result： The positive expression rates of PI3K and Akt in CCA tissues were higher than those in paracancer and normal bile duct tissues （P<0.05）. The positive expression rate of PTEN in CCA tissues was lower than that in paracancer and normal bile duct tissues （P<0.05）. There were significant differences in the positive expression rates of PI3K， Akt and PTEN in CCA， paracancer and normal bile duct tissues （P<0.05）. The presence of nerve invasion， depth of infiltration， lymph node metastasis and TNM stage were the relevant factors for the positive expression of PI3K， Akt and PTEN in CCA tissues （P<0.05）. PI3K and Akt were negatively correlated with the expression of PTEN in CCA tissues （r=-0.635， -0.506， P<0.001）， while PI3K was positively correlated with the expression of Akt in CCA tissues （r=0.332， P=0.023）. Conclusion： The PI3K/Akt signaling pathway is overexpressed in CCA tissues， which may be involved in the occurrence and development of CCA， and can be used as an evaluation indicator of biological behavior， PI3K/Akt signaling pathway is expected to become a molecular target for clinical intervention of CCA.

近年來，膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）的發病率逐年升高，因極具侵襲轉移特性，且發病隱匿，導致大多數患者確診即為晚期，盡管根治性手術切除對部分膽管癌患者預后有所獲益，但5年生存率仍不高，中位生存時間僅1～2年，預后極差，因此一直是臨床上的難治性疾病之一[1-2]。在人類腫瘤譜中均發現有活動異常的信號通路，推測其可能參與腫瘤發生、發展。研究發現磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B， PI3K/Akt）信號轉導通路在多種惡性腫瘤中存在異常失調現象，此通路中相關成分突變可引起通路功能異常，不僅參與癌細胞增殖分化和凋亡，還與癌細胞的侵襲轉移、促腫瘤新生血管生成以及拮抗放化療等密切相關[3-4]。PI3K作為催化磷脂酰肌醇物質的特異性激酶，通過活化Akt參與細胞增殖、分化及凋亡，Akt是PI3K下游靶蛋白，可啟動下游底物調控細胞周期、抑制凋亡及促血管生成，而負性調控因子PTEN功能丟失可激活PI3K/Akt信號通路，參與腫瘤發生發展。本研究對PI3K、Akt及PTEN在CCA中的表達情況進行分析，旨在探討其在CCA發生發展中的作用及其與CCA生物學行為的關系，從而為CCA的預防及治療提供新思路，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年1月-2017年1月本院47例CCA患者的癌組織及對應癌旁組織（距離腫瘤2～3 cm）標本。另選擇同期14例正常膽管組織標本（因外傷等原因切除的標本）。納入標準：年齡25～75歲，均接受CCA根治手術且經術后病理學檢查確診為CCA;術前均未接受放化療等腫瘤相關治療;有完整的臨床病理資料及隨訪資料。排除標準：既往或同期合并有其他惡性腫瘤相關疾病的患者。所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書，本研究已經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法與試劑 采用免疫組化（SP）法檢測PI3K、Akt及PTEN蛋白在CCA組織、癌旁組織及正常膽管組織中的表達情況。所有標本手術切除后均經10%甲醛固定及石蠟包埋，4 μm厚度連續切片。主要試劑包括兔抗人PI3K單克隆抗體、兔抗人Akt單克隆抗體、兔抗人PTEN多克隆抗體、SP二抗及DAB試劑盒均全套購自北京中杉生物技術有限公司，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。用公司提供的已知陽性組織作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 判定標準 采用雙盲法由兩位有經驗的病理醫師對切片免疫組化染色結果進行判讀。PI3K、Akt及PTEN蛋白的陽性表達均以細胞漿出現背景清晰的棕黃或棕褐色顆粒為標準。PI3K及PTEN蛋白表達于細胞質;Akt蛋白主要表達于細胞質，部分表達于細胞核。判定標準：（1）按切片中陽性細胞所占百分比計分：陽性細胞<25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分;（2）按切片中陽性染色強度計分：無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據陽性細胞所占比例及陽性染色強度進行綜合評分，兩項乘積≤4分記為陰性表達，>4分記為陽性表達。

1.4 統計學處理 采用SPSS 23.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析;生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較 CCA及癌旁組織標本男31例，女16例;年齡42～72歲，平均（52±11）歲。正常膽管組織標本男9例，女5例;年齡25～75歲，平均（46±17）歲。兩組一般資料比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 PI3K、Akt及PTEN蛋白在CCA、癌旁組織及正常膽管組織中的表達 CCA組織中PI3K與Akt的陽性表達率均高于癌旁組織和正常膽管組織，差異均有統計學意義（P<0.05）;CCA組織中PTEN陽性表達率均低于癌旁組織和正常膽管組織，差異均有統計學意義（P<0.05）;CCA組織、癌旁組織及正常膽管組織的PI3K、Akt及PTEN陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P<0.05），但癌旁組織和正常膽管組織PI3K、AKT及PTEN陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.3 CCA組織中PI3K、AKT及PTEN蛋白陽性表達的相關因素分析 有無神經侵犯、浸潤深度、淋巴結轉移情況及TNM分期為PI3K、Akt及PTEN蛋白在CCA組織中陽性表達的相關因素，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.4 PI3K、AKT及PTEN蛋白在CCA組織中表達的相關性 PI3K、Akt均與PTEN在CCA組織中的表達呈負相關（r=-0.635、-0.506，P<0.001），而PI3K與Akt在CCA組織中的表達呈正相關（r=0.332，P=0.023）。見表3。

3 討論

CCA是惡性程度極高、預后較差的惡性腫瘤之一。由于肝膽外科技術的發展與一系列新治療方法的建立，CCA的無病生存期已逐漸延長，但是其復發率仍然很高，遠期療效較差[5-6]。在分子生物學方面，目前研究認為CCA的發生發展與侵襲轉移是多基因、蛋白及細胞因子共同調控的復雜過程。PI3K/Akt是細胞中普遍存在的一種信號通路，可通過調控細胞周期、能量代謝及蛋白合成等途徑在細胞增殖、分化與凋亡過程中發揮重要生理功能，此通路中某些成分的改變可導致細胞發生轉化，而所致的功能缺失或獲得在腫瘤細胞的增殖分化與侵襲轉移等過程中起重要作用[7-9]。抑癌基因PTEN可通過對PI3K/Akt信號通路的負性調控而發揮抑制腫瘤形成的功能，PTEN失活則可降低對該通路的抑制作用而導致細胞癌變[10]。PI3K/Akt信號通路在CCA發生發展中發揮重要作用，主要表現為抑制肝癌細胞凋亡和促進細胞生存、促進腫瘤細胞的侵襲、轉移及腫瘤血管生成，因此，針對本通路的靶向治療已成為CCA研究焦點。

癌基因PI3K是磷脂激酶家族重要成員，為一種由調節亞基p85和催化亞基p110組成的異源二聚體，主要存在于細胞質內，具有激酶活性，可將刺激性信號由細胞膜傳導至細胞漿[11-12]。PI3K具有抗細胞凋亡作用，Bertram等[13]研究證實PI3K抗凋亡功能可能通過抑制Fas凋亡而實現的。Banumathy等[14]則認為PI3K可引起Akt突變而使細胞失去正常生理功能，且誘發腫瘤生成，達到抑制腫瘤細胞凋亡的作用。本研究結果顯示，CCA組織中PI3K蛋白陽性表達率明顯高于癌旁組織及正常膽管組織（P<0.05），提示PI3K可能與CCA發生、發展有關，而其機制則可能是通過促進癌細胞增殖和抑制CCA細胞凋亡而實現。且分析顯示當存在淋巴結轉移、高侵襲性及腫瘤分期晚等高危因素時，CCA中PI3K蛋白的陽性表達率相應增高，提示在CCA的侵襲轉移方面PI3K亦發揮著作用。

Akt為一種主要存在胞漿中在進化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由480個氨基酸殘基組成，是PI3K下游蛋白。AKT的基本結構含有催化活性區，活性區中包含Thr308及Ser473位點，Akt通過血小板-白細胞C激酶同源區與PI3K相結合而使兩位點磷酸化而被激活，進而發揮調控腫瘤細胞凋亡的生理功能[15-17]。早期Liu等[18]通過基因芯片技術發現HCC細胞中Akt的表達較正常肝臟組織明顯升高。而Duronio等[19]研究證實Akt失活的等位基因可以改變其致癌現象。亦有研究顯示Akt可激活內皮型NO合酶磷酸化而產生與血管新生關系密切的NO[20]。本研究發現，CCA組織中Akt蛋白陽性表達率高于癌旁組織與正常膽管組織，且隨著侵襲性增高和病理分期升高其陽性率增加，提示CCA中Akt的表達增高與惡性進展密切相關，可能在CCA惡性演進中發揮重要作用。Akt抑制劑MK-2206是當前針對PI3K/Akt通路的研究熱點，抑制Akt的功能可消除PI3K/Akt通路介導的增殖信號，抑制周期細胞活性，誘導腫瘤細胞凋亡[21]。

PTEN定位于人類第10q23.3染色體上，是具有雙特異性磷酸脂酶活性的抑癌基因。其通過催化PI3K（3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇脫磷酸）去磷酸化還原為PIP2（4，5-二磷酸磷脂酰肌醇）實現對PI3K/Akt信號通路的負性調節，達到抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用[10]。因此PTEN的缺失或失活會引起PI3K/Akt信號通路高度激活，導致此通路的活化及促進下游信號分子活性。PTEN在多種腫瘤組織中低表達，如結直腸癌、子宮內膜癌、前列腺癌、小細胞肺癌等[22-23]。已有研究證實PTEN表達缺失與CCA發生發展密切相關[24]。本研究發現PTEN在CCA組織中陽性表達率明顯低于癌旁組織及正常膽管組織（P<0.05），其表達與腫瘤大小、病理分級、侵襲性及病理分期均相關，表明PTEN參與了CCA發生發展，PIEN表達缺失或低表達導致其抑制正常細胞惡性轉化的能力降低，進而使細胞癌變、增強細胞增殖、分化能力，與CCA惡性進展、高侵襲轉移特性密切相關。

本研究中PI3K、Akt均與PTEN在CCA組織中的表達呈負相關（r=-0.635、-0.506，P<0.001），表明PI3K、Akt與PTEN在CCA發生發展中可能相互拮抗，CCA中PTEN表達缺失可能引起PI3K、Akt的活化失去抑制作用，導致PI3K、Akt過度表達，使PI3K/AKT通路處于持續活化狀態，造成細胞增殖加快，促進腫瘤惡性進展。此外，PI3K與AKT在CCA組織中的表達呈正相關（r=0.332，P=0.023），提示PI3K和Akt兩者協同促進CCA發生、發展及惡化進展。

綜上所述，PI3K/Akt信號通路在CCA中過度表達可能與抑癌基因PTEN表達缺失有關，進而使PI3K、Akt的活化失去抑制作用，造成該通路持續活化，促進CCA細胞發生發展及侵襲轉移等惡性進展。PI3K/Akt信號通路中的相關蛋白可作為生物學行為的評估指標，今后圍繞PI3K/Akt信號通路開展CCA基因治療，有望成為抑制CCA惡性進展、提高患者生存率的新手段。

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（收稿日期：2020-02-27） （本文編輯：田婧）