復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組織中miRNA-200c的表達(dá) 及作用機(jī)制研究

恒聰 李鎮(zhèn)宇 鄧敏峰 曹志愷

【摘要】 目的：探討各級(jí)別及復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤中miRNA-200c（miR-200c）的表達(dá)及可能機(jī)制。方法：收集本院收治的43例膠質(zhì)瘤手術(shù)患者腫瘤切除標(biāo)本，按照組織學(xué)分級(jí)不同將43例膠質(zhì)瘤手術(shù)患者分為低級(jí)別膠質(zhì)瘤組15例、高級(jí)別膠質(zhì)瘤組22例、復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組6例，另選取10例正常腦組織標(biāo)本為對(duì)照組。使用RT-PCR檢測(cè)各級(jí)別初發(fā)膠質(zhì)瘤及復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中miR-200c的表達(dá)水平，通過Western blotting檢測(cè)腫瘤干性指標(biāo)（CD133、Nestin）及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）標(biāo)志物（E-cadherin、N-cadherin和Vimentin）在各組織中的表達(dá)。結(jié)果：各組miR-200c表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別升高逐漸降低，兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;各組Nestin表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別升高逐漸升高，E-cadherin表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別升高逐漸降低，兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;高級(jí)別膠質(zhì)瘤組、復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組CD133表達(dá)水平均較對(duì)照組、低級(jí)別膠質(zhì)瘤組顯著升高（P<0.05）;高級(jí)別膠質(zhì)瘤組、復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著升高（P<0.05），且復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平均較低級(jí)別膠質(zhì)瘤組、高級(jí)別膠質(zhì)瘤組顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：miR-200c在復(fù)發(fā)及高級(jí)別膠質(zhì)瘤中表達(dá)下降，其缺失可能誘導(dǎo)EMT使腫瘤干性增加，可作為高級(jí)別及復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 miR-200c 復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤 上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞

[Abstract] Objective： To investigate the expression and possible mechanism of miRNA-200c （miR-200c） in different grades of glioma and recurrent glioma. Method： The tumor resection specimens of 43 patients with glioma were collected， according to the histological classification， 43 patients were divided into low-grade glioma group （15 cases）， high-grade glioma group （22 cases） and recurrent glioma group （6 cases）， another 10 normal brain tissues were selected as the control group. RT-PCR was used to detect the expression of miR-200c in primary and recurrent glioma， Western blotting was used to detect the expression of tumor dryness index （CD133， Nestin） and epithelial mesenchymal transition （EMT） markers （E-cadherin， N-cadherin， Vimentin） in various tissues. Result： The miR-200c expression level of each group decreased with the increase of glioma grade， the differences between the two groups were statistically significant （P<0.05）. The Nestin expression level of each group increased with the increase of glioma grade， the E-cadherin expression level of each group decreased with the increase of glioma grade， the differences between the two groups were statistically significant （P<0.05）. The expression level of CD133 in high-grade glioma group and recurrent glioma group were significantly higher than those in control group and low-grade glioma group （P<0.05）. The expression levels of N-cadherin and Vimentin in high-grade glioma group and recurrent glioma group were significantly higher than those in the control group （P<0.05）， and the expression levels of N-cadherin and Vimentin in the recurrent glioma group were significantly higher than those in the low-grade glioma group and the high-grade glioma group （P<0.05）. Conclusion： The expression of miR-200c decreased in recurrent and high-grade glioma， and the absence of miR-200c may induce EMT to increase tumor dryness， which may be a potential target for the treatment of high-grade and recurrent glioma.

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，具有發(fā)病率、致死率高的特點(diǎn)，其中高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者的平均生存期僅為12～15個(gè)月[1-2]。目前膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的機(jī)制仍不明確，有學(xué)者認(rèn)為目前的常規(guī)治療并未能有效地清除膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞（glioma stem cells，GSCs），所以復(fù)發(fā)也就在所難免[3]。有研究證實(shí)，腫瘤干細(xì)胞和上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）之間有密切聯(lián)系[4-5]，而MicroRNA（miR）-200c是調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞EMT過程的重要分子[6]。盡管miR-200c在各類腫瘤中均有不同程度的改變，其是否參與膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)仍需要進(jìn)一步探討。該研究采用RT-PCR方法檢測(cè)miR-200c在各級(jí)別及復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，并通過Western blotting分析EMT相關(guān)分子（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）及腫瘤干性相關(guān)分子（NESTIN、CD133）在各組織樣本中表達(dá)情況，探討miR-200c在復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤發(fā)放發(fā)展中的作用，為復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤的診治提供前期基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源及分組 收集2017年1月-2019年12月本院收治的43例膠質(zhì)瘤手術(shù)患者腫瘤切除標(biāo)本，男28例、女15例;年齡<50歲24例、年齡≥50歲19例;腫瘤直徑<5 cm 16例、腫瘤直徑≥5 cm 27例;根據(jù)WHO 2007年中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)：初發(fā)患者中Ⅰ級(jí)7例、Ⅱ級(jí)8例、Ⅲ級(jí)13例、Ⅳ級(jí)9例，復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤為二次及多次手術(shù)患者6例（病理均為WHO Ⅳ級(jí)）。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有初發(fā)患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療;所有患者術(shù)后均行同步放化療（同步放化療采用直線加速器放療，根據(jù)頭顱MRI定位，采用局部擴(kuò)大放療，總劑量60 Gy，分30次，共6周），口服替莫唑胺75 ms/（m2·d），共42 d。排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤術(shù)后未進(jìn)行放化療及術(shù)后病理分級(jí)為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)的不納入組。另選取同期10例正常腦組織標(biāo)本為對(duì)照組，均取自同期因顱腦損傷或腦出血需行內(nèi)減壓術(shù)的患者，術(shù)后病理檢查證實(shí)均為正常腦組織。按照組織學(xué)分級(jí)不同將43例膠質(zhì)瘤手術(shù)患者分為低級(jí)別膠質(zhì)瘤組（WHO-Ⅰ/Ⅱ級(jí)）15例、高級(jí)別膠質(zhì)瘤組（WHO-Ⅲ/Ⅳ級(jí)）22例、復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組（WHO-Ⅳ級(jí)）6例。該研究獲得廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)同意及患者家屬簽字認(rèn)可，操作符合臨床試驗(yàn)倫理規(guī)范。

1.2 RT-PCR法檢測(cè)各組miR-200c 常規(guī)Trizol試劑抽提總RNA，無酶水溶解沉淀。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA提取液的A260及A280吸光度值，檢測(cè)RNA純度和濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按轉(zhuǎn)錄miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海吉瑪生物技術(shù)有限公司）說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系：5×RT緩沖液4 μL、1 μmol/L miRNA特異性RT引物1.2 μL、25 mmol/L鎂離子3 μL、10 mmol/L dNTP 0.75 μL、40 U/μL RNA酶抑制劑0.25 μL、200 U/μL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.2 μL、RNA 1 μg，用無酶水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：25 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。采用SYBR方法，應(yīng)用Biorad公司的定量PCR儀IQ5進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，U6作為內(nèi)對(duì)照。反應(yīng)體系：2×PCR緩沖液10 μL、5 μmol/L miRNA特異性PCR引物0.4 μL、RT產(chǎn)物1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL、無酶水加至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s、62 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)。

miR-200c的相對(duì)表達(dá)量通過公式2-△Ct計(jì)算，其中，△Ct=miR-200c平均Ct值-U6平均Ct值。

1.3 Western blotting檢測(cè)各組相關(guān)分子表達(dá)情

況 裂解液冰上裂解各組組織提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，每孔上樣量為40 μg。按SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明配置10%分離膠，電泳液，140 V電壓電泳1.5 h。按分子量切取相應(yīng)目的條帶，280 MA濕轉(zhuǎn)80 min。封閉液（用1×TBST稀釋的5% BSA）封閉1 h。加入兔抗人Nestin（1︰1 000）、CD133（1︰1 000）、E-cadherin（1︰1 000）、N-cadherin（1︰1 000），鼠抗人Vimentin（1︰100）、β-Actin一抗（1︰500），雜交袋4 ℃孵育過夜。1×TBST洗膜3次，5 min/次。加入山羊抗兔、山羊抗鼠IgG二抗（1︰10 000），室溫孵育1 h。1×TBST洗膜3次，5 min/次。ECL化學(xué)發(fā)光法曝光顯影。以image J分析條帶的灰度值。所需抗體均采購(gòu)自Abcam公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 22.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)或Dunnetts T3檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料比較 各組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

2.2 各組miR-200c表達(dá)比較 檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、低級(jí)別膠質(zhì)瘤組、高級(jí)別膠質(zhì)瘤組、復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組miR-200c表達(dá)水平分別為（12.327±1.737）、（7.998±0.978）、（1.720±0.315）、（1.279±0.301），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=371.890，P=0.000），且各組miR-200c表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別升高逐漸降低，兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2.3 各組腫瘤干性指標(biāo)表達(dá)比較 Werstern blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示，各組間CD133、Nestin表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;其中高級(jí)別膠質(zhì)瘤組、復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組CD133表達(dá)水平均較對(duì)照組、低級(jí)別膠質(zhì)瘤組顯著升高，且復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組CD133表達(dá)水平較高級(jí)別膠質(zhì)瘤組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;各組Nestin表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別升高逐漸升高，兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2、圖2。

2.4 各組EMT相關(guān)分子表達(dá)比較 各組N-cadherin、E-cadherin、Vimentin表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;其中高級(jí)別膠質(zhì)瘤組、復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著升高（P<0.05），且復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平均較低級(jí)別膠質(zhì)瘤組、高級(jí)別膠質(zhì)瘤組顯著升高（P<0.05）;各組E-cadherin表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別升高逐漸降低，兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3、圖3。

3 討論

膠質(zhì)瘤是成人常見的顱內(nèi)腫瘤，其中惡性程度高的膠質(zhì)瘤侵襲性強(qiáng)，手術(shù)難以完全切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差[7]。而手術(shù)后放、化療等序貫治療還是難以避免膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)，這和腫瘤干細(xì)胞的存在有一定的關(guān)系。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為腫瘤組織或者腫瘤轉(zhuǎn)移灶中存在極少且具有無限自我更新能力并可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的細(xì)胞-腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞（cancer stem like cells，CSLCs）[8]。這類細(xì)胞具有成體干細(xì)胞的某些功能特征，包括自我增殖和多向分化的能力，稱為“干性（stemness）”[9]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞在放化療抵抗和腫瘤復(fù)發(fā)過程中起關(guān)鍵作用[10]，而目前的常規(guī)治療可能并未能有效地清除這些細(xì)胞，所以復(fù)發(fā)也就在所難免[3]。因此深入探討腫瘤干性與復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤的分子機(jī)制尤為重要。

miR為在真核細(xì)胞生物體中廣泛存在的非編碼小分子單鏈RNA，可以參與調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，并在其侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起促進(jìn)或抑制作用。因此通過檢測(cè)各級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中miR表達(dá)情況，可對(duì)其預(yù)后的判斷提供重要依據(jù)。有研究表明miR-200家族成員（miR-200s）在晚期癌癥中經(jīng)常被沉默。在膠質(zhì)瘤中同樣可見miR-200b的低表達(dá)[11]。文獻(xiàn)[12]報(bào)道，miR-200c在人乳腺腫瘤干細(xì)胞及非致瘤癌細(xì)胞中存在差異性表達(dá)，可通過調(diào)節(jié)干細(xì)胞因子BMI1，抑制正常乳腺干細(xì)胞分化為乳腺小管，也可以抑制乳腺癌干細(xì)胞的成瘤能力。miR-200c下調(diào)在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，重新表達(dá)miR-200可逆轉(zhuǎn)腫瘤標(biāo)志物的特點(diǎn)[13]。腫瘤標(biāo)志物表型的主要特點(diǎn)（無黏附力和增加細(xì)胞活力的能力）在目前的研究中都被確定為miR-200c的直接調(diào)控[14]。本研究結(jié)果顯示，各組miR-200c表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別升高逐漸降低，兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示miR-200c在正常腦組織中的表達(dá)情況明顯高于膠質(zhì)瘤組織，且miR-200c的表達(dá)情況與膠質(zhì)瘤的級(jí)別呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，特別是在復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤中其表達(dá)經(jīng)常被沉默。說明了在生長(zhǎng)活躍、惡性程度高的膠質(zhì)瘤中miR-200c水平明顯下降。

另一方面，miR不僅能參與調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，并對(duì)正常胚胎干細(xì)胞的自我更新能力以及細(xì)胞分化能力起著重要的調(diào)節(jié)作用。目前越來越多的研究表明，EMT參與腫瘤的侵襲及遷移并與腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特征密切相關(guān)。EMT通過改變腫瘤的微環(huán)境使腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性[15-18]，并在腫瘤轉(zhuǎn)移、治療抵抗和再?gòu)?fù)發(fā)中起關(guān)鍵作用[4-5]。同樣miR-200家族成員（miR-200s）亦參與了EMT過程。miR-200抑制EMT，上皮細(xì)胞獲得遷移、侵襲和間質(zhì)細(xì)胞抗凋亡的能力。筆者研究了miR-200c是否調(diào)節(jié)通過調(diào)節(jié)EMT過程從而通過影響腫瘤干性調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展及復(fù)發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，在EMT的過程中伴隨著上皮標(biāo)記分子E-cadherin的下調(diào)和間充質(zhì)標(biāo)記分子N-cadherin的上調(diào)。本研究檢測(cè)EMT相關(guān)分子（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）及腫瘤干性相關(guān)分子（NESTIN、CD133）在各組織樣本中表達(dá)情況，結(jié)果顯示，高級(jí)別膠質(zhì)瘤組、復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組CD133表達(dá)水平均較對(duì)照組、低級(jí)別膠質(zhì)瘤組顯著升高，且復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組CD133表達(dá)水平較高級(jí)別膠質(zhì)瘤組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;各組Nestin表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別升高逐漸升高，E-cadherin表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別升高逐漸降低，兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;高級(jí)別膠質(zhì)瘤組、復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著升高（P<0.05），且復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平均較低級(jí)別膠質(zhì)瘤組、高級(jí)別膠質(zhì)瘤組顯著升高（P<0.05）。上述結(jié)果與EMT的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)一致，且與本研究中腫瘤干性指標(biāo)及miR-200c表達(dá)趨勢(shì)相一致，且Siebzehnrubl等[19]指出在膠質(zhì)瘤和正常腦組織中可出現(xiàn)N-cadherin的明顯升高。上述結(jié)果提示，復(fù)發(fā)及高級(jí)別膠質(zhì)瘤Vimentin表達(dá)明顯增高、E-cadherin表達(dá)明顯減少，的確有EMT的發(fā)生;但在低級(jí)別膠質(zhì)瘤中，相比正常組織，EMT標(biāo)記分子變化不明顯，表明在低級(jí)別膠質(zhì)瘤中EMT不是其侵襲、遷移的主要特征。

綜上所述，復(fù)發(fā)及高級(jí)別膠質(zhì)瘤比起正常組織及低級(jí)別膠質(zhì)瘤，腫瘤細(xì)胞干性明顯增強(qiáng)，并有明確的EMT發(fā)生，且miR-200c表達(dá)水平也同各分子表達(dá)呈線性相關(guān)趨勢(shì)。證實(shí)了miR-200c參與調(diào)控了復(fù)發(fā)及惡性膠質(zhì)瘤EMT發(fā)生，并調(diào)控了其腫瘤細(xì)胞的干性，這三者緊密聯(lián)系，可能是膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的重要原因之一。miR-200c一方面可以調(diào)控EMT發(fā)生，另一方面調(diào)控腫瘤細(xì)胞的干性，可以認(rèn)為是EMT和腫瘤干細(xì)胞的樞紐調(diào)控分子。但對(duì)于其中調(diào)控的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究，從而尋找一條治療膠質(zhì)瘤的新道路。

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（收稿日期：2020-03-05） （本文編輯：董悅）