凡納濱對蝦6個國內群體的遺傳背景分析*

李旭鵬 欒 生 曹寶祥 羅 坤譚 建 孔張偉 孟憲紅 孔 杰

凡納濱對蝦6個國內群體的遺傳背景分析*

李旭鵬1,2欒 生1,2曹寶祥1羅 坤1,2譚 建1孔張偉1孟憲紅1,2①孔 杰1,2①

(1. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島 266071；2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266071)

本研究選取了來自國內6個不同育苗場的凡納濱對蝦()群體，對8個SSR位點的基因型信息進行分析。結果顯示，觀察等位基因數(a)平均值為3.67~9.33，有效等位基因數(e)平均值為2.20~5.67，觀察雜合度(o)平均值為0.12~0.71，期望雜合度(e)平均值為0.41~0.81，多態性信息含量(PIC)平均值為0.36~0.76。聚類分析結果顯示，來自于同一個育苗場的對蝦聚在一個分支。不同品牌來源的對蝦分別聚在幾個不同分支。6個群體間的遺傳一致度為0.4229~0.8265，遺傳距離為0.1905~0.8607。遺傳分化系數(ST)是0.1837，群體內近交系數(IS)是0.2514，o

凡納濱對蝦；遺傳多態性；遺傳距離；SSR

凡納濱對蝦()的野生群體分布在太平洋東岸(墨西哥、厄瓜多爾、秘魯等)。從20世紀末被引入我國開展養殖后，凡納濱對蝦已經發展成為國內最主要的海水養殖對蝦種類，產量占海水養殖對蝦總量的80%。國內養殖業對于凡納濱對蝦親蝦的依賴巨大。由于國內親蝦不足以滿足生產，每年需要從國外進口大量成本高的親蝦。但是，通常這些親蝦的遺傳背景和系譜信息無法得知。使用這些親蝦配對生產的后代苗種可能存在遺傳多態性低的情況，隨著培育代數的增加，近交變的更易發生，經濟性狀衰退明顯。因此，培育國內優質凡納濱對蝦新品種意義重大。目前，已經證明遺傳多態性的降低和近交情況能夠增加隱性有害等位基因的表達，對選育群體的生長、存活、抗逆等性狀造成近交衰退現象(Spielman, 2004; Moss, 2007; Goyard, 2008; Luo, 2014; 喻馳方等, 2013)。因此，在凡納濱對蝦遺傳選育工作中，為維持育種群體的遺傳多樣性，避免近交，需要認清不同群體甚至個體間的分子遺傳背景差異，為制定合理配種方案提供參考。

微衛星(SSR)標記是一種廣泛存在于生物基因組內的共顯性標記，擁有遺傳多態性高的特點。研究表明，SSR適合于遺傳多樣性分析(Valles-Jimenez, 2004; Perez-Enriquez,2009; Rezaee, 2016)。國內在21世紀初期已有利用SSR對黃渤海不同中國對蝦()群體的遺傳多樣性進行調查研究，區分不同地理群體間的親緣關系距離，為種質資源利用和新品種選育提供了很好的參考(劉萍等, 2004; 孟憲紅等, 2008)。由于SSR位點信息量大、分型技術成本低的優點，近年來依然被應用在對蝦遺傳多樣性分析中(王軍等, 2018; 趙志英等, 2018)。本研究使用8對SSR引物，隨機對采集于我國的6個凡納濱對蝦群體進行分析，為遺傳育種工作中對不同遺傳背景的凡納濱對蝦資源的利用提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

隨機從6家育苗場共收集133尾凡納濱對蝦，對其遺傳背景進行分析。來自于6家育苗場的對蝦分別編號為CP-1、CP-2、CP-3、CP-4、PRI和SIS群體。其中，CP-1、CP-2、CP-3、CP-4群體來自于同一個品牌。PRI和SIS群體分別來自2個不同品牌。21尾凡納濱對蝦來自CP-1群體；20尾來自CP-2群體；11尾來自CP-3群體；10尾來自CP-4群體；61尾來自PRI群體；10尾來自SIS群體。所有群體的對蝦都孵化于同一年。在養殖場用消毒的剪刀取一條對蝦游泳足，保存于95%酒精，帶回實驗室用于DNA提取和分析。

1.2 DNA提取

使用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(天根)從對蝦游泳足的肌肉組織中提取DNA。分別使用分光光度計和瓊脂糖電泳檢測DNA的質量。合格的DNA用于后期SSR分型實驗。

1.3 SSR分型

使用8對已公開發表的凡納濱對蝦SSR引物(Meehan, 2003; Alcivar-Warren, 2007; Zhang, 2007)進行實驗。引物序列信息詳見表1。PCR反應體系包括12.5 μl Premix? (TaKaRaVersion 2.0) (TaKaRa0.625 U、dNTPs 0.4 mmol/L、Tris-HCl 20 mmol/L、KCl 100 mmol/L、MgCl23 mmol/L) (TaKaRa)，1 μl模板DNA (200 ng/μl)，1 μl正向引物(10 μmol/L)，1 μl反向引物(10 μmol/L)， 9.5 μl去離子水。反應程序如下：98℃ 3 min；98℃ 30 s，60℃ 10 s，72℃ 1 min，25個循環；72℃延伸 3 min。使用ABI 3730XL測序儀(Applied Biosystems, 美國)獲得每個SSR位點的基因型信息。

表1 引物信息

Tab.1 Primer information

1.4 遺傳多樣性分析

觀察等位基因數(a)、有效等位基因數(e)、觀察雜合度(o)、期望雜合度(e)、HWE檢驗、遺傳一致度、遺傳距離和-統計量使用POPGene(Version 1.32)軟件(https://sites.ualberta.ca/~fyeh/popgene.html)進行計算。使用NTSYSpc (Version 2.10)軟件(http://www. exetersoftware.com/cat/ntsyspc/ntsyspc.html)進行UPGMA聚類分析。使用Cervus (Version 3.0.7)軟件(http://www. fieldgenetics.com)計算多態性信息含量(PIC)。

2 結果

2.1 遺傳多態性分析

6個凡納濱對蝦群體的遺傳多態性信息見表2。其中，a平均值為3.67~9.33。e平均值為2.20~5.67。o平均值為0.12~0.71。e平均值為0.41~0.81。除了在CP-4群體中的Lv12位點只檢測到1種等位基因，其他SSR位點在6個群體中的等位基因數都大于1。 8個SSR位點的PIC平均值為0.36~0.76。M1103位點在CP-1、CP-3和PRI群體中都顯著偏離HWE (<0.05)。Lv12位點在CP-2和PRI群體中都極顯著偏離HWE(<0.01)。TuMXLv10.33位點在CP-2、CP-3、CP-4和PRI群體中都極顯著偏離HWE(<0.01)。TuMXLv8.256位點在CP-4群體中顯著偏離HWE (<0.05)；在CP-1、CP-2、CP-3和PRI群體中極顯著偏離HWE(<0.01)。TuMXLv7.56位點在CP-4群體中顯著偏離HWE(<0.05)。TuMXLv9.90位點在CP-3群體中顯著偏離HWE(<0.05)；在PRI群體中極顯著偏離HWE(<0.01)。TuMXLv7.21和TuMXLv9.103位點在所有群體中都沒有發生偏離HWE。

表2 遺傳多樣性分析

Tab.2 Genetic diversity analysis

2.2 分子遺傳距離分析

圖1是個體的聚類分析結果。所有來自于CP-1、CP-3和CP-4群體的凡納濱對蝦集中在第1分支。其余來自于CP-2、SIS和PRI群體的凡納濱對蝦分別集中于另外3個分支。除了個體水平，在群體水平也進行了聚類分析(圖2)，在2個水平的聚類分析結果是相符的。6個群體間的遺傳一致度和遺傳距離結果見表3。從表3可以看出，遺傳一致度為0.4229~0.8265。遺傳距離為0.1905~0.8607。其中，CP-1和CP-4群體間的遺傳一致度最高，遺傳距離最近。CP-2和SIS群體間的遺傳一致度最低，遺傳距離最遠。

圖1 個體水平聚類分析

圖2 群體水平聚類分析

表3 遺傳一致度和遺傳距離

Tab.3 Genetic identity and genetic distance

注：對角線上方為遺傳一致度，下方為遺傳距離

Note: The numbers above the diagonal line are genetic identities, and the numbers below the diagonal line are genetic distances

2.3 F-統計量

對6個凡納濱對蝦群體進行-統計量分析(表4)。結果表明，8個SSR位點的群體內近交系數(IS)值為?0.0426~0.6943。多數位點的IS>0。IS平均值是0.2514。8個SSR位點的總群體近交系數(IT)值為0.0416~0.7665，IT平均值為0.3889。8個SSR位點的遺傳分化系數(ST)值為0.0808~0.3003。ST平均值為0.1837。

表4-統計量分析

Tab.4 The F-statistics analysis

2.4 等位基因的差異

韋恩圖(圖3)展示的是3個品牌凡納濱對蝦8個SSR位點的等位基因的分布情況。8個SSR位點共計獲得等位基因個數是126。其中，只有12個等位基因類型是在3個品牌的凡納濱對蝦中都有發現。CP、PRI、SIS品牌的凡納濱對蝦各有36、29、4個等位基因類型是各自特有的，分別占各自所有等位基因類型的比例是40.9%、38.7%和12.5%。單獨對CP的4個群體(CP-1、CP-2、CP-3和CP-4)進行分析(圖4)，4個群體共計有88個等位基因類型，其中，4個群體共有的有10種。CP-1、CP-2、CP-3和CP-4群體各自擁有14、20、10、4種特有的等位基因，分別占各自所有等位基因類型的比例是28.0%、44.4%、23.8%和16.0%。

圖3 3個品牌間SSR等位基因類型分布

圖4 CP品牌的4個群體SSR等位基因類型分布

3 討論

SSR標記廣泛應用于生物的遺傳多樣性調查。在前期研究中，Xu等(2001)利用6對SSR引物對菲律賓的野生斑節對蝦()遺傳多樣性進行研究，結果顯示，其中1個野生群體的遺傳多樣性要明顯低于其他3個野生群體，研究結果為了解斑節對蝦的野生資源情況提供了參考。Rumisha等(2017)利用SSR標記調查了斑節對蝦的遺傳多態性與當地水域金屬污染水平的相關性，結果顯示，遺傳多態性的改變與金屬污染存在顯著的相關性。王軍等(2018)利用SSR對中國對蝦人工選育群體和野生群體進行比較分析，結果顯示，人工選育群體與野生群體間發生弱遺傳分化。

本研究中，a平均值為3.67~9.33。在Perez- Enriquez等(2009)研究中，凡納濱對蝦SSR的a平均值為8.98。Cruz等(2004)和Rezaee等(2016)的研究中，凡納濱對蝦SSR的a值為5~10。上述研究結果和本研究結果相近。但是有趣的是，凡納濱對蝦與其他幾種對蝦相比，SSR的a值顯得偏低很多。例如，Wang等(2016)研究表明，中國對蝦的a為6~63。Zhang等(2015)研究表明，中國對蝦SSR的a平均值為36.5。Luan等(2006)研究表明，日本囊對蝦()SSR的a平均值為7.5~ 13.5。Xu等(2001)關于斑節對蝦的報道中，SSR的a值為6~54。上述對蝦種類都比凡納濱對蝦SSR的a值高。考慮到凡納濱對蝦SSR位點普遍存在a值偏低的情況，在進行遺傳多樣性分析時，最好能選用多態性高的SSR位點，或者適當增加分析位點的個數。已有報道中凡納濱對蝦SSR位點a值偏低的現象是否與人工選擇相關也值得探索。

聚類分析結果表明，來自6個群體的凡納濱對蝦主要分為4支。其中，來自CP-1、CP-3和CP-4群體的凡納濱對蝦組成第1分支，表明這3個群體來源的對蝦遺傳距離較近。來自CP-2、PRI和SIS群體的對蝦分別聚在其他3個分支，提示這3個群體來源的對蝦之間遺傳距離較遠。有趣的是，CP-1、CP-2、CP-3和CP-4群體都是來源于同一個品牌，但CP-2群體與CP-1、CP-3和CP-4群體的遺傳距離較遠，甚至比SIS群體與CP-1、CP-3和CP-4群體的距離還遠，顯示該品牌群體間遺傳背景較為豐富，品牌內遺傳距離甚至高于品牌間遺傳距離。通過聚類分析結果可以看出，使用本研究的8對SSR引物，可以將不同品牌間的個體準確區分開。但同一個品牌的群體間個體，還不能被全部準確區分開，原因可能是這些群體的親本親緣關系太近。

本研究中，o值為0.12~0.71。8個位點的雜合度在不同群體中的差別較大。PIC值為0.36~0.76，SSR位點的多態性較高，達到中高度水平(Botstein, 1980)，適合遺傳多樣性分析。ST平均值為0.1837，表明群體間已經達到高度遺傳分化水平(0.15~0.25) (Balloux,2002)，18.37%的遺傳分化存在于各群體間。

對于等位基因類型在不同品牌凡納濱對蝦中的分布情況，3個品牌共有的等位基因類型并不多。尤其是CP和PRI 2個品牌的凡納濱對蝦特有的等位基因類型比例較高。提示這2個品牌的對蝦擁有更獨特的遺傳信息。但是與CP、PRI 2個品牌的對蝦相比，SIS品牌的對蝦特有的等位基因類型比例較低。CP品牌的4個群體中，CP-2特有的等位基因類型最高，達到44.4%，說明CP-2與其他3個CP品牌群體的遺傳背景差異較大，這個結果和聚類分析的結果是一致的。假如在遺傳選育中要將這6個群體引入基礎選育群體，那么參考SSR分型結果，可將CP-1、CP-3、CP-4群體合并成1個群體看待，CP-2、SIS、PRI各自是3個獨立群體。制定配種方案可優先考慮在這 4個新定義的群體間進行個體間配對，盡量避免群體內部個體的配對。

已有研究表明，控制近交在對蝦育種中的重要性。近交對于凡納濱對蝦生長、存活、抗病毒等性狀具有顯著影響(Moss, 2007)。在中國對蝦的研究中同樣也表明，近交對于生長和存活性狀具有顯著影響(Luo, 2014)。在沒有系譜參考的情況下，經過幾代人工選育群體內近交水平就可能達到極高水平。而遺傳信息豐富的基礎選育群體也是保證人工選育更好開展的前提。因此，在以未知遺傳背景的群體作為選育對象時，借助分子標記技術對群體、個體間的分子遺傳背景進行分析，可以為配種方案制定提供重要的參考。本研究中計算的IS>0，表明群體內存在雜合度降低現象；綜合考慮o

4 結論

本研究表明，不同品牌來源的凡納濱對蝦間的分子遺傳距離較遠，利用SSR標記可以準確區分。但是相同品牌的對蝦，即使來自于不同群體，個體間的分子遺傳距離可能很近。本研究檢測的群體內可能已經存在一定近交現象。在遺傳選育或者生產擴繁苗種過程中，為了控制近交、提高遺傳多樣性，在缺少候選親本遺傳背景信息時，可以嘗試利用SSR標記對群體或個體的分子遺傳背景進行調查，并計算分子遺傳距離用于配種方案參考。

Alcivar-Warren A, Meehan-Meola D, Park SW,. ShrimpMap: A low-density, microsatellite-based linkage map of the pacific whiteleg shrimp,: Identification of sex-linked markers in linkage group 4. Journal of Shellfish Research, 2007, 26(4): 1259–1277

Balloux F, Lugon-Moulin N. The estimation of population differentiation with microsatellite markers. Molecular Ecology, 2002, 11(2): 155–165

Botstein D, White RL, Skolnick M,. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment lengthpolymorphisms. American Journal of Human Genetics, 1980, 32(3): 314–331

Cruz P, Ibarra AM, Mejia-Ruiz H,. Genetic variability assessed by microsatellites in a breeding program of pacific white shrimp (). Marine Biotechnology, 2004, 6(2): 157–164

Goyard E, Goarant C, Ansquer D,. Cross breeding of different domesticated lines as a simple way for genetic improvement in small aquaculture industries: heterosis and inbreeding effects on growth and survival rates of the Pacific blue shrimp(). Aquaculture, 2008, 278(1–4): 43–50

Liu P, Meng XH, He YY,. Genetic diversity in three wild populations of shrimpin Yellow and Bohai Seas as revealed by microsatellite DNA. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2004, 35(3): 252–257 [劉萍, 孟憲紅, 何玉英, 等. 中國對蝦()黃、渤海3個野生地理群遺傳多樣性的微衛星DNA分析. 海洋與湖沼, 2004, 35(3): 252–257]

Luan S, Kong J, Wang QY. Genetic variation of wild and cultured populations of the Kuruma prawn(Bate 1888) using microsatellites. Aquaculture Research, 2006, 37(8): 785–792

Luo K, Kong J, Luan S,. Effect of inbreeding on survival, WSSV tolerance and growth at the postlarval stage of experimental full-sibling inbred populations of the Chinese shrimp. Aquaculture, 2014, 420– 421(3): 32–37

Meehan D, Xu Z, Zuniga G,. High frequency and large number of polymorphic microsatellites in cultured shrimp,()(Crustacea: Decapoda). MarineBiotechnology (New York), 2003, 5(4): 311–330

Meng XH, Kong J, Wang QY,. Study on seven geographic populations of prawnbased on microsatellite DNA. Marine Fisheries Research, 2008, 29(5): 1–10 [孟憲紅, 孔杰, 王清印, 等. 微衛星技術對黃、渤海海域7個不同地理群體中國對蝦的遺傳結構和遺傳分化研究. 海洋水產研究, 2008, 29(5): 1–10]

Moss DR, Arce SM, Otoshi CA,. Effects of inbreeding on survival and growth of Pacific white shrimp(). Aquaculture, 2007, 272(S1): 30–37

Perez-Enriquez R, Hernández-Martínez F, Cruz P. Genetic diversity status of White shrimp()broodstock in Mexico. Aquaculture, 2009, 297 (1–4): 44–50

Rezaee S, Farahmand H, Nematollahi MA. Genetic diversity status of Pacific white shrimp () using SSR markers in Iran. AquacultureInternational, 2016, 24(2): 479–489

Rumisha C, Leermakers M, Elskens M,. Genetic diversity of the giant tiger prawnin relation to trace metal pollution at the Tanzanian coast. Marine Pollution Bulletin, 2017,114(2): 759–767

Spielman D, Brook BW, Briscoe DA,. Does inbreeding and loss of genetic diversity decrease disease resistance? ConservationGenetics, 2004, 5(4): 439–448

Valles-Jimenez R, Cruz P, Perez-Enriquez R. Population genetic structure of Pacific white shrimp () from Mexico to Panama: Microsatellite DNA variation. Marine Biotechnology,2004, 6(5): 475–484

Wang M, Wang W, Xiao G,. Genetic diversity analysis of spawner and recaptured populations of Chinese shrimp () during stock enhancement in the Bohai Bay based on an SSR marker. Acta Oceanologica Sinica, 2016, 35(8): 51–56

Wang J, Wang QY, Kong J,. SSR analysis on genetic diversity in breeding and wild populations of. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(2): 104–111 [王軍, 王清印, 孔杰, 等. 中國明對蝦人工選育群體與野生群體遺傳多樣性的SSR分析. 漁業科學進展, 2018, 39(2): 104–111]

Xu Z, Primavera JH, de la Pena LD,. Genetic diversity of wild and cultured Black Tiger Shrimp () in the Philippines using microsatellites. Aquaculture, 2001, 199(1): 13–40

Yu CF, Luan S, Zhang ZW,. Growth performance comparison of different inbreeding levels of families in. Progress in Fishery Sciences, 2013, 34(6): 75–79 [喻馳方, 欒生, 張志偉, 等. 中華鹵蟲不同近交水平家系生長性能比較. 漁業科學進展, 2013, 34(6): 75–79]

Zhao ZY, Liang LY, Bai LR. Analysis of genetic diversity among three wild populations ofusing microsatellite marker. Journal of Tropical Oceanography, 2018, 37(3): 65–72 [趙志英, 梁麗運, 白麗蓉. 斑節對蝦3個野生群體遺傳多樣性的微衛星標記分析. 熱帶海洋學報, 2018, 37(3): 65–72]

Zhang K, Xiao G, Wang W,. Genetic variation analysis across six life periods in a natural population of the Chinese shrimp “” in Bohai Bay using SSR markers. Russian Journal of Marine Biology, 2015, 41(1): 10–16

Zhang L, Yang C, Zhang Y,. A genetic linkage map of Pacific white shrimp (): Sex-linked microsatellite markers and high recombination rates. Genetica,2007, 131(1): 37–49

Genetic Background Analysis of Six Groups of White Shrimpin China Using SSR Markers

LI Xupeng1,2, LUAN Sheng1,2, CAO Baoxiang1, LUO Kun1,2,TAN Jian1, KONG Zhangwei1, MENG Xianhong1,2①, KONG Jie1,2①

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071)

Controlling the inbreeding level is an important task in animal breeding. Genetic analysis such as genetic diversity and genetic distance estimate could provide information for the artificial selection of animals. In the present study, the genetic information of Pacific white shrimpfrom six different populations in China were analyzed using genotyping data of eight SSR loci. The results showed that the meanaranged from 3.67 to 9.33, the meanerange from 2.20 to 5.67, the meanoranged from 0.12 to 0.71, the meaneranged from 0.41 to 0.81, and the meanPIC ranged from 0.36 to 0.76. The cluster analysis results showed that the individual shrimps from populations of different companies were clustered in different nodes. Theindividual shrimps from three hatcheries from the same company were clustered in one node. Among the six populations of., the genetic identity ranged from 0.4229 to 0.8265, and the genetic distance ranged from 0.1905 to 0.8607. The mean value ofSTwas 0.1837. TheISvalue was0.2514. And theovalue was smaller than theevalue. The results suggested that genetic diversity between.from different populations could be high, while, genetic relationship of.in populations of the same company might be quite close. There might be an inbreeding phenomenon.

; Genetic diversity; Genetic distance; SSR

S917.4

A

2095-9869(2020)03-0103-08

10.19663/j.issn2095-9869.20190123001

孟憲紅, 研究員, E-mail: mengxianhong@ysfri.ac.cn；孔 杰，研究員，E-mail: kongjie@ysfri.ac.cn

2019-01-23,

2019-04-21

* 國家自然科學基金聯合基金項目(U1706203)、泰山學者種業人才團隊項目、國家自然科學基金面上項目(41676148; 31572616)、現代農業產業技術體系專項資金(CARS-48)和山東省農業良種工程(2017LZN011)共同資助[This work was supported by Joint Fund of National Natural Science Foundation of China (U1706203), Taishan Scholar Program for Seed Industry, National Natural Science Foundation of China (41676148; 31572616), China Agriculture Research System (CARS-48), and Shandong Province Agricultural Seed Improvement Project (2017LZN011)]. 李旭鵬，E-mail: patrickxp@163.com

http://www.yykxjz.cn/

李旭鵬, 欒生, 曹寶祥, 羅坤, 譚建, 孔張偉, 孟憲紅, 孔杰. 凡納濱對蝦6個國內群體的遺傳背景分析. 漁業科學進展, 2020, 41(3): 103–110

Li XP, Luan S, Cao BX, Luo K, Tan J, Kong ZW, Meng XH, Kong J. Genetic background analysis of six groups of white shrimpin China using SSR markers. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(3): 103–110

MENG Xianhong, E-mail: mengxianhong@ysfri.ac.cn; KONG Jie, E-mail: kongjie@ysfri.ac.cn

(編輯 馬璀艷)