一種復合益生菌對凡納濱對蝦抗副溶血弧菌感染能力的影響*

2020-06-09 11:31:44楊運楷宋曉玲王海亮謝國駟

漁業科學進展 2020年3期

楊運楷宋曉玲王海亮謝國駟黃倢

楊運楷1,2宋曉玲2①王海亮2謝國駟2黃倢2

(1. 上海海洋大學上海 201306；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室農業農村部海水養殖病害防治重點實驗室青島市海水養殖流行病學與生物安保重點實驗室青島 266071)

本研究選擇1株地衣芽孢桿菌() BL-9、1株枯草芽孢桿菌() BS-12、1株金麗假交替單胞菌() CDM8，以1∶1∶1將其組成復合益生菌，各益生菌水體添加濃度為107CFU/ml，進行為期30 d的凡納濱對蝦()養殖實驗。實驗分為暫養期(7 d)、益生菌處理期(15 d)、副溶血弧菌()攻毒期(10 d)。結果顯示，養殖水體中添加復合益生菌能顯著增加水體和對蝦腸道可培養細菌總數(<0.05)，攻毒實驗結束時，實驗組對蝦累積存活率為(73.33±6.83)%，顯著高于陽性對照組(25.33±15.43)%。對蝦抗病基因熱激蛋白70 (Heat shock proteins 70,)、β-1,3-葡聚糖結合蛋白-脂蛋白(Beta-1,3-glucan-binding protein-lipoprotein,)、脂多糖-β-1,3-葡聚糖結合蛋白(Lipopolysaccharide-β-1, 3-glucan binding protein,)、抗菌肽在益生菌處理階段均出現不同程度的上調，在攻毒階段雖呈現各自不同的表達情況，但所有基因都經歷了更大幅度上調。研究表明，水體中添加芽孢桿菌和假交替單胞菌組成的復合益生菌可提高凡納濱對蝦抗副溶血弧菌感染能力，對蝦抗病力的提高可能與益生菌增加對蝦腸道可培養細菌數量、抗病相關基因表達水平及過氧化氫酶(CAT)活性有關。

凡納濱對蝦；復合益生菌；副溶血弧菌；免疫基因；過氧化氫酶

致急性肝胰腺壞死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)是近5年來嚴重危害全球對蝦養殖業發展的疫病之一，該病是由攜帶基因的弧菌引起的一類細菌性疾病。目前，已報道的致AHPND弧菌包括副溶血弧菌()、坎貝氏弧菌()、歐文氏弧菌()等(賈丹等, 2018)。本研究所用副溶血弧菌為本實驗室在2013年從廣西患AHPND的凡納濱對蝦()中分離出1株致病性副溶血弧菌(AHPND-causing,AHPND)，編號為20130629002S01。該菌對鹵蟲無節幼體的半致死濃度(LD50)為2.58×105CFU/ml(王娜等, 2016; 陳蒙蒙等, 2018)。

益生菌是指在一定濃度范圍內能夠提高機體健康的活性微生物制劑，作為抗生素及化學藥劑的替代品，在醫學、食品、養殖等領域已經得到了快速的發展(Balcázar, 2006)。益生菌在水產養殖過程中的作用機理有以下幾個方面：一是通過細菌自身代謝分解食物或產生消化酶提高機體消化能力；二是競爭性抑制，通過競爭營養、附著位點或合成、分泌抗菌活性因子等來抑制有害微生物的繁殖；三是通過降低水體中的氨氮等有害物質改善養殖水環境；四是通過增強機體免疫功能來提高抗病能力等(Thompson, 1999; Balcázar, 2006)。高戈等(2017)使用巨大芽孢桿菌()進行凡納濱對蝦生物絮團養殖實驗，養殖結束時，添加巨大芽孢桿菌組的對蝦體長、體重均顯著高于其他2組。張盛靜等(2015)研究發現，在飼料中添加單一益生菌或復合益生菌均可顯著提高對蝦抗副溶血弧菌感染的能力，且復合益生菌的保護效果更佳。

芽孢桿菌在水產養殖中的應用較為廣泛。劉觀斌等(2015)在養殖水體中潑灑適當濃度的枯草芽孢桿菌()可以改善水質，提高羅非魚機體的免疫力、抗氧化能力，進而提高羅非魚抗無乳鏈球菌()病的能力。張歡歡等(2016)研究發現，生物絮團對蝦養殖系統中添加菌株02，能改善菌群結構，抑制弧菌生長。作者在前期的研究工作發現，在凡納濱對蝦養殖水體中單獨添加107CFU/ml數量級的地衣芽孢桿菌()BL-9、枯草芽孢桿菌BS-12菌液后，使用副溶血弧菌進行攻毒，實驗組相對于對照組均顯著提高對蝦的成活率。金麗假交替單胞菌()CDM8具有突出的弧菌拮抗能力(Wang, 2018)，在零交換水條件下，能顯著提高凡納濱對蝦ZⅢ幼體和仔蝦PL5的變態率和成活率(孫博超等, 2019)。因此，本研究選擇上述3株菌組成復合益生菌添加到養殖水體中，評價其對養殖水體及凡納濱對蝦腸道菌群、抗副溶血弧菌感染能力、過氧化氫酶(CAT)活性、抗病基因表達水平的影響，以期為復合益生菌在凡納濱對蝦養殖中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 對蝦與益生菌

1.1.1 實驗用凡納濱對蝦實驗用凡納濱對蝦購自山東萊州單山水產養殖公司(體長為6.2~10.6 cm)。實驗前參照OIE(2017)水生動物疾病診斷手冊及Wang等(2018)中的PCR方法，進行AHPND病原的套式PCR檢測，結果為陰性。投喂飼料為寧波天邦飼料有限公司生產的凡納濱對蝦全熟化顆粒飼料，對蝦養殖容器為100 L的PC塑料桶，養殖有效水體為60 L的過濾海水。

1.1.2 實驗用菌種及培養實驗用菌株：金麗假交替單胞菌CDM8、地衣芽孢桿菌BL-9、枯草芽孢桿菌S-12、副溶血弧菌20130629002S01，均由本實驗室分離、鑒定及保存。

菌液發酵采用2216E培養基，28℃恒溫震蕩培養，當菌液的OD580 nm≈1時(此時，細菌濃度約為2×109~3×109CFU/ml)，終止發酵，使用時通過稀釋的方法調整細菌的水體添加濃度。

CDM8、BL-9、BS-12和副溶血弧菌在水體的添加濃度分別為2.24×107、2.93×107、2.77×107和2.13× 105CFU/ml。

1.2 實驗期及實驗分組

實驗分3個時期：暫養期、益生菌處理期、副溶血弧菌感染期。

暫養期：對蝦不分組，共7 d。期間隨機挑選 12尾凡納濱對蝦進行病原檢測，暫養第7天檢測養殖水體及對蝦腸道可培養細菌數量，采集對蝦肝胰腺組織用于抗病基因表達及CAT酶活性檢測。暫養穩定后，挑選630尾大小均勻、活力良好的對蝦用于后續實驗。

益生菌處理期：對蝦分為實驗組和對照組。每組7個平行，其中，3個用于統計死亡率，4個用于采樣(對照組為2組，預先設置攻毒階段的陰性和陽性對照組)。實驗組養殖水體中添加復合益生菌，各菌以1∶1∶1比例添加，對照組不添加益生菌。實驗周期為15 d，由于CDM8拮抗能力較強，所以益生菌添加采取交替添加的方式，即3 d為1個添加周期。第1天添加益生菌CDM8菌液，第2天添加BL-9和BS-12菌液，共5個添加周期。在益生菌處理期，第7天和第14天檢測養殖水體及對蝦腸道可培養細菌數量，采集對蝦肝胰腺組織用于抗病基因表達及酶活性檢測。

副溶血弧菌攻毒期：對蝦分為3組，實驗組、陽性對照組和陰性對照組，每組7個平行，其中，3個用于統計死亡率，4個用于采樣。益生菌處理期，每桶包含對蝦30尾，攻毒期調整為每桶25尾。實驗組和陽性對照組使用副溶血弧菌浸浴攻毒，先將對蝦于2.13×107CFU/ml副溶血弧菌菌液中浸泡15 min，然后放回，向養殖水體中添加副溶血弧菌菌液使得水體中的弧菌濃度達到2.13×105CFU/ml左右，陰性對照組使用無菌2216E培養基浸浴。副溶血弧菌攻毒期持續10 d，攻毒期間不添加益生菌。在攻毒的6、18、42、66、90 h采集對蝦的肝胰腺組織進行實驗相關指標的測量，并統計每天對蝦的累積死亡率。

1.3 實驗管理

實驗期間連續充氣，水溫控制在(28±1)℃。根據每天對蝦桶內是否有殘餌來調整投喂量，每天投喂 2次。48 h換水1次，換水量為水體積的2/3。

1.4 樣品及處理

1.4.1 水體和對蝦腸道內可培養細菌計數水體及對蝦腸道細菌計數采用2216E瓊脂平板涂布計數的方式。對蝦腸道活菌計數，先將對蝦完整腸道加入無菌PBS緩沖液研磨，后進行活菌計數。

1.4.2 對蝦肝胰腺樣品采集及處理在各個取樣時間點采集對蝦肝胰腺，每桶取對蝦2尾，每組3個平行，共6尾對蝦。解剖采集的對蝦肝胰腺經液氮迅速冷凍后，放置在–80℃超低溫冰箱保存。

1.5 RNA提取及cDNA合成

按TRIZOL Reagent (Invitrogen)說明書進行總RNA的抽提，用Nanodrop 2000c (Thermo)測定RNA濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量后，保存于–80℃備用。cDNA合成采用TaKaRa公司生產的反轉錄試劑盒進行，使用方式參考試劑盒說明書。

1.6 實時熒光定量PCR

1.6.1 實時熒光定量PCR及引物使用Fast Essential DNA Green Master熒光定量試劑盒(Roche, 瑞士)進行實時熒光定量PCR檢測，方法參考試劑盒說明書。抗病相關基因的檢測引物名稱及序列見表1。

1.6.2 熒光定量體系及反應程序 PCR反應體系包括SYBR Premix ExTM(2×) 12.5 μl，cDNA模板1 μl，上下游引物各0.5 μl (10 μmol/L)，DEPC處理水10.5 μl。PCR反應條件：94℃，5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環。每個組織的樣品設3個重復。對實驗結果采用2?DDCt法進行相對定量分析(Livak, 2001)。

1.7 免疫酶活性檢測

對各組凡納濱對蝦肝胰腺組織進行CAT酶活測定，測定方法參照檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進行。

1.8 數據分析與處理

采用SPSS 16.0軟件對實驗數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，以Duncan’s多重比較進行不同處理間的顯著性分析，<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 益生菌處理期養殖水體及對蝦腸道可培養細菌數量

養殖水體可培養細菌數量見圖1A，在添加益生菌前(0 d)，各組水體可培養細菌數量處于105CFU/ml數量級(>0.05)。益生菌處理階段第7天和第14天實驗組水體可培養細菌數量均處于107CFU/ml數量級，顯著高于對照組(<0.05)。對蝦腸道可培養細菌數量見圖1B，在添加益生菌前(0 d)凡納濱對蝦腸道細菌總數在104CFU 數量級，添加益生菌后實驗組對蝦腸道內可培養細菌數量第7天(3.22×104CFU)，第14天(3.54×104CFU)均顯著高于對照組(第7天為3.04× 104CFU, 第14天為3.03×104CFU) (<0.05)。

2.2 副溶血弧菌攻毒后各組對蝦累積存活率

副溶血弧菌攻毒后取實驗組和陽性對照組瀕死對蝦肝胰腺組織，用TCBS平板涂布培養，長出大量綠色菌落，與攻毒所用副溶血弧菌菌落形態相同。實驗組和陽性對照組的對蝦均在第18小時開始出現死亡。攻毒后258 h時，實驗組和陰性對照組對蝦的累積存活率分別為73.33%和86.67%，而陽性對照組對蝦的累積存活率為25.33%。實驗組比陽性對照組累積存活率提高了48.00% (表2)。

表1 實時熒光定量PCR所用的引物及序列

Tab.1 Primer sequences used in quantitive real-time PCR

圖1 養殖水體(A)及對蝦腸道(B)可培養細菌總數

不同字母代表同一時間點不同組之間存在顯著差異，“*”代表同一組之間不同時間點存在顯著差異。下同

Different letters in the same time mean significantly different at 0.05 level (<0.05), “*” means significantly different at 0.05 level in the same group (<0.05). The same as below

2.3 對蝦肝胰腺組織免疫基因相對表達量

2.3.1基因的相對表達量益生菌處理期，凡納濱對蝦肝胰腺的相對表達量測定結果見圖2A。第7天和第14天實驗組基因表達量顯著高于對照組(<0.05)。攻毒期，凡納濱對蝦肝胰腺的相對表達量測定結果見圖2B。實驗組和陽性對照組表達均呈現上升后下降的趨勢，均在18 h達到最大值(<0.05)。

2.3.2基因的相對表達量益生菌處理期，凡納濱對蝦肝胰腺的相對表達量測定結果見圖3A，第7天和第14天實驗組基因表達量均顯著高于對照組(<0.05)。攻毒期，凡納濱對蝦肝胰腺的相對表達量測定結果見圖3B，實驗組對蝦的的表達量呈先升高后下降趨勢，而陽性對照組呈先升高再下降，再升高再下降的趨勢；實驗組和陽性對照組基因的表達量分別在6和66 h達到最高(<0.05)。

2.3.3基因的相對表達量益生菌處理期，凡納濱對蝦肝胰腺的相對表達量測定結果見圖4A。實驗組基因表達量在第7天和第14天均顯著高于對照組(<0.05)。攻毒期，凡納濱對蝦肝胰腺的相對表達量測定結果見圖4B。實驗組和陽性對照組基因的表達均呈先升高后下降的趨勢，實驗組基因表達量在42 h達到最大值，陽性對照組中基因在18 h基因達到最大值。

2.3.4基因的相對表達量益生菌處理期，凡納濱對蝦肝胰腺的相對表達量測定結果見圖5A，實驗組表達量在第7天顯著高于對照組，而在第14天時表達量則低于對照組的(<0.05)。攻毒期，凡納濱對蝦肝胰腺的相對表達量測定結果見圖5B，實驗組和陽性對照組基因的表達量均呈先升高后下降的趨勢，攻毒42 h以后，實驗組對蝦的表達量高于陽性對照組(<0.05)。

表2 凡納濱對蝦感染副溶血弧菌后累積存活率

Tab.2 Accumulative survival rate of L. vannamei post V. parahaemolyticus challenge (%; n=3; ±SD)

注：同列中數據后面不同字母表示顯著性差異(<0.05)

Note: Different letters in the same column mean significantly different (<0.05)