大口黑鱸彈狀病毒的分離培養(yǎng)及其卵黃抗體的制備*

袁雪梅 呂孫建 施偉達(dá) 杭小英 劉 莉 吳穎蕾

大口黑鱸彈狀病毒的分離培養(yǎng)及其卵黃抗體的制備*

袁雪梅 呂孫建 施偉達(dá) 杭小英 劉 莉①吳穎蕾

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省魚類健康與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省淡水水產(chǎn)研究所 湖州 313001)

本研究從爆發(fā)性死亡的大口黑鱸()魚苗病樣中分離培養(yǎng)1株大口黑鱸彈狀病毒(rhabdovirus, MSRV)毒株，采用甲醛滅活大口黑鱸彈狀病毒，制備佐劑滅活疫苗，免疫產(chǎn)蛋雞，收集高免蛋，制備MSRV卵黃抗體，測(cè)定其效價(jià)、中和效果及對(duì)病毒復(fù)制和宿主細(xì)胞內(nèi)凝集素基因()表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，成功利用草魚()卵巢細(xì)胞株CO細(xì)胞分離培養(yǎng)大口黑鱸魚彈狀病毒，并用于佐劑滅活疫苗的制備；MSRV佐劑滅活疫苗免疫蛋雞，成功獲得MRSV的卵黃抗體，效價(jià)為1∶256，稀釋度為1∶64時(shí)的中和病毒的作用最為明顯，中和作用率達(dá)38.29%以上，病毒核酸拷貝數(shù)明顯降低。同時(shí)，還可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)凝集素的表達(dá)。研究表明，特異性卵黃抗體對(duì)大口黑鱸彈狀病毒具有明顯的中和效果，為后續(xù)卵黃抗體作為免疫制劑的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

大口黑鱸；彈狀病毒；卵黃抗體；病毒中和

大口黑鱸()俗稱加州鱸，原產(chǎn)于美國(guó)加利福尼亞州密西西比河水系，肉質(zhì)鮮美、在市場(chǎng)上很受歡迎，加之具有生長(zhǎng)迅速、易起捕、適溫范圍廣、耐低氧能力強(qiáng)等特點(diǎn)，一直深受養(yǎng)殖戶的歡迎(樊佳佳等, 2019)。我國(guó)年產(chǎn)量超過30萬(wàn)t，是全球產(chǎn)量最高的國(guó)家(鄧國(guó)成等, 2011)。近年來(lái)，大口黑鱸已逐漸成為跑道式循環(huán)水養(yǎng)殖的主要養(yǎng)殖品種。但無(wú)論是傳統(tǒng)的高密度養(yǎng)殖，還是跑道式集中圈養(yǎng)模式，都存在著疫病快速傳播的潛在危險(xiǎn)。其中，病毒性病害的爆發(fā)，常造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。彈狀病毒(Rhabdovirus)為一種單股不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，種類較多，包括175種以上的成員，可感染脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物和植物。魚類彈狀病毒因宿主廣、毒株種類多、毒力強(qiáng)等特點(diǎn)，對(duì)各種淡水和海水魚造成了嚴(yán)重危害(Zhang, 2018)。近幾年，在大口黑鱸苗種培育及養(yǎng)殖早期流行一種可引起大口黑鱸魚苗大量死亡的疾病，給鱸魚養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雷燕等(2015)結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查及分子生物學(xué)鑒定，確認(rèn)引起廣東省佛山市一大口黑鱸養(yǎng)殖池塘魚種暴發(fā)性死亡的疾病為彈狀病毒病，其病原為彈狀病毒。尋找敏感細(xì)胞是病毒體外培養(yǎng)的關(guān)鍵，而病毒的體外培養(yǎng)又是后續(xù)研究的基礎(chǔ)。目前，已報(bào)道的用于大口黑鱸彈狀病毒體外培養(yǎng)的細(xì)胞僅有大口黑鱸皮膚(LBS)細(xì)胞一種(Gao, 2018)。

卵黃抗體(IgY)是指從免疫禽蛋中提取出的針對(duì)特定抗原的抗體，具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、產(chǎn)量高、成本低、特異性強(qiáng)且無(wú)任何毒副作用的優(yōu)勢(shì)；由于與魚類種系發(fā)生距離遠(yuǎn)，不會(huì)發(fā)生交叉血清學(xué)反應(yīng)。卵黃抗體對(duì)某些動(dòng)物疫病具有明顯治療和緊急預(yù)防作用；純化后的卵黃抗體還可用于病毒的檢測(cè)(陳斌等, 2005)。卵黃抗體應(yīng)用于水生動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療屢見報(bào)道。特異性卵黃抗體可較好地保護(hù)感染白斑綜合癥病毒的斑節(jié)對(duì)蝦，顯著提高斑節(jié)對(duì)蝦的存活率(Kumaran, 2010)，用抗溶藻弧菌卵黃抗體拌喂感染溶藻弧菌的鮑魚，可顯著降低鮑魚的死亡率(Wu, 2011)。Sunwoo等(2010)發(fā)現(xiàn)，特異性卵黃抗體能抑制大腸桿菌(987P)的生長(zhǎng)。程娜(2014)研究發(fā)現(xiàn)，抗鰻利斯頓氏菌()卵黃抗體可明顯提高感染鰻利斯頓氏菌香魚()的存活率。由于大口黑鱸彈狀病毒主要危害5 cm以下的鱸魚苗種，而這一階段的魚苗免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，主動(dòng)免疫預(yù)防難以實(shí)現(xiàn)，加之發(fā)病急，病程短，以抗體作為被動(dòng)免疫的預(yù)防措施更具有生產(chǎn)實(shí)踐意義。本研究在成功分離培養(yǎng)大口黑鱸彈狀病毒的基礎(chǔ)上，針對(duì)大口黑鱸病毒制備卵黃抗體，研究其對(duì)大口黑鱸彈狀病毒的中和作用，為大口黑鱸彈狀病毒病的防治與診斷試劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

彈狀病毒感染的大口黑鱸魚苗病樣采自浙江省湖州市某苗種場(chǎng)，草魚()卵巢細(xì)胞株(CO)由實(shí)驗(yàn)室保存。180日齡的健康蛋雞由浙江湖州楊家埠雞場(chǎng)提供，10只進(jìn)行免疫，5只用作陰性對(duì)照。

1.2 主要試劑

弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))；細(xì)胞培養(yǎng)基M199、胎牛血清及雙抗均購(gòu)自GIBCO公司；TRIZOL總RNA提取試劑、ExDNA聚合酶和pGEM-T連接試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司(日本)；反轉(zhuǎn)錄和定量PCR試劑購(gòu)自TOYOBO公司(日本)；2×PCR Master Mix購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的羊抗雞抗體、TMB顯色試劑盒、MTT細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司(上海)；引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)試劑。

1.3 大口黑鱸感染彈狀病毒檢測(cè)及分離培養(yǎng)

取10尾患病大口黑鱸魚苗置于冰上研磨，采用TRIZOL試劑提取組織總RNA，參考雷燕等(2015)的方法，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。經(jīng)PCR檢測(cè)后，取感染MSRV的大口黑鱸魚苗，勻漿后離心，取上清液，過濾除菌，濾液即為粗提的病毒原液。采用草魚卵巢細(xì)胞株CO細(xì)胞作為大口黑鱸彈狀病毒的敏感細(xì)胞，以含10%胎牛血清的M199完全培養(yǎng)基培養(yǎng)CO細(xì)胞至匯片60%~80%時(shí)，上述病毒粗提液用M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基1∶5倍稀釋后感染細(xì)胞，吸附1.5~2 h后，吸出未吸附病毒液，添加M199維持液繼續(xù)培養(yǎng)48~72 h，出現(xiàn)細(xì)胞病變50%以上，收獲病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物，置于–80℃保存?zhèn)溆谩４送?，根?jù)已公布的MSRV核酸序列(GenBank No: MK397811)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增特異性產(chǎn)物構(gòu)建質(zhì)粒，用于制備定量檢測(cè)病毒核酸的標(biāo)準(zhǔn)品。同時(shí)，設(shè)計(jì)用于熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸、內(nèi)凝集素()和內(nèi)參的引物。所用引物具體信息見表1。

1.4 大口黑鱸彈狀病毒滅活疫苗的制備及免疫

病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物凍融、離心，取上清液，加入甲醛使終濃度為0.5%，密封后置于65℃滅活2 h，每30 min搖勻1次。冷卻至室溫，加入青霉素和鏈霉素(雙抗?jié)舛葹?00 μg/ml)，分裝封口，4℃保存。將滅活的大口黑鱸彈狀病毒分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑按1∶1體積比混合，完全乳化后得弗氏完全佐劑乳化疫苗和弗氏不完全佐劑乳化疫苗，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用上述制備的佐劑乳化疫苗采用胸肌多點(diǎn)注射的方式，免疫180~190日齡的產(chǎn)蛋雞。分別于1、7、14和28 d免疫，共免疫4次，每次免疫1 ml/只。第1次采用弗氏完全佐劑乳化疫苗免疫，其他時(shí)間點(diǎn)用弗氏不完全佐劑乳化疫苗免疫。免疫5周后，從第35天開始收集雞蛋，每天收集免疫雞所產(chǎn)的雞蛋，總共收集20 d。同時(shí)，以注射PBS作為對(duì)照組，免疫程序與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.5 卵黃抗體的制備及效價(jià)測(cè)定

收集的雞蛋經(jīng)表面消毒，在無(wú)菌條件下取蛋黃倒入燒杯中，加入8倍體積的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.2)，攪拌10 min，4℃沉淀過夜，吸取上清液，10000 r/min離心15 min，收集上清液，加入飽和硫酸銨沉淀抗體蛋白，12000 r/min離心，收集沉淀，超純水重懸，透析去除卵黃抗體中殘留的鹽離子。采用SDS-PAGE檢測(cè)卵黃抗體純度，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定濃度。

表1 本研究所用引物

Tab.1 Primers used in this study

采用ELISA測(cè)定卵黃抗體效價(jià)。首先，制備MSRV蛋白，在MSRV病毒液中加入適量RIPA(含1 mmon/L PMSF)，混勻后，置于冰上30 min，12000 r/min離心10 min，上清液即為病毒蛋白。病毒蛋白用PBS稀釋后鋪板，每孔100 μl，4℃包被過夜；之后，PBST洗滌3次后，加入倍比稀釋的卵黃抗體，每孔100 μl，37℃孵育1 h，洗滌3次后，再加入羊抗雞二抗，于37℃孵育1 h，洗滌3次后，加TMB底物顯色，最后，加入10%硫酸溶液終止反應(yīng)。

1.6 卵黃抗體的抗病毒效果及其對(duì)內(nèi)凝集素基因(intelectin)表達(dá)的影響

1.6.1 卵黃抗體對(duì)病毒的中和作用 首先，測(cè)定病毒半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)，即MSRV病毒原液進(jìn)行10倍稀釋，分別接種CO細(xì)胞，每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)重復(fù)。24℃培養(yǎng)96 h，記錄病變細(xì)胞數(shù)和未病變細(xì)胞數(shù)，按Reed-Muech法計(jì)算TCID50。

以每孔100個(gè)TCID50病毒量與倍比稀釋的卵黃抗體混勻，24℃作用2 h后接種細(xì)胞，同時(shí)，設(shè)正常細(xì)胞孔對(duì)照及100 TCID50/孔、0.1 TCID50/孔的病毒對(duì)照，當(dāng)100 TCID50/孔全部病變，而0.1 TCID50/孔中無(wú)病變時(shí)，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活量，按公式計(jì)算中和作用率：

作用率(%)=[(給藥組平均值–病毒對(duì)照平均值)/ (正常細(xì)胞對(duì)照組平均值–病毒對(duì)照平均值)]×100%

1.6.2 卵黃抗體對(duì)彈狀病毒復(fù)制的影響 參考 劉珍等(2016)的方法制備標(biāo)準(zhǔn)品，使用引物MSRV-F1/ MSRV-R1擴(kuò)增病毒核酸特異性片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與載體pGEM-T連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，并測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)定重組質(zhì)粒DNA濃度，換算成拷貝數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)品原液。以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，MSRV-F2和MSRV-R2為引物，進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min 19 s，共40個(gè)循環(huán)。得出計(jì)算病毒核酸拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

卵黃抗體與等體積的病毒液混合，24℃作用2 h后接種細(xì)胞，同時(shí)，設(shè)置病毒對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照。于接種后第6、12、24、48和72小時(shí)收集細(xì)胞病毒液，TRIZOL提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄參照TOYOBO公司的“ReverTra Ace qPCR RT Master Mix”試劑盒合成cDNA。使用引物MSRV-F2/MSRV-R2對(duì)樣品cDNA進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到樣品中病毒RNA的拷貝數(shù)。

1.6.3 卵黃抗體對(duì)CO細(xì)胞中表達(dá)的影響

按照1.6.2所述步驟處理樣品，得到的樣品cDNA分別用引物intelectin-F/intelectin-R和β-actin-F/β- actin-R進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序同1.6.2。得到的數(shù)據(jù)利用2–ΔΔCt方法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用軟件SPSS 16.0的單因素方差分析(One-way ANOVA)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，<0.05為顯著性差異，<0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 彈狀病毒核酸檢測(cè)及分離培養(yǎng)

患病大口黑鱸魚苗的主要癥狀表現(xiàn)為停止攝食，水面漫游，打轉(zhuǎn)，體色發(fā)黑，鰓和腹部充血(圖1a)。采用特異性引物對(duì)患病魚組織核酸進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期372 bp相符(圖1b)。

利用患病魚組織制備的病毒粗提液接種CO細(xì)胞后，24 h開始出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞收縮變圓，聚集成團(tuán)，出現(xiàn)明顯的空斑(圖2)。細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，同樣可擴(kuò)增出大口黑鱸彈狀病毒的特異性片段。

2.2 卵黃抗體制備及濃度、純度和效價(jià)測(cè)定

收集免疫后的雞蛋蛋黃，純化后得到的卵黃抗體濃度為1.8 mg/ml，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，從圖3可以看出，在50~75 kDa和25~37 kDa之間有明顯的條帶，與卵黃抗體輕鏈和重鏈大小預(yù)期相符(He, 2011)。ELISA測(cè)得卵黃抗體的效價(jià)為1∶256。

2.3 卵黃抗體的中和作用及對(duì)病毒復(fù)制的影響

病毒TCID50經(jīng)測(cè)定為104.12。卵黃抗體倍比稀釋后，與病毒作用后接種CO細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)卵黃抗體中和作用率，結(jié)果顯示，1/64倍稀釋的卵黃抗體對(duì)病毒的中和作用最為明顯，中和作用率為38.29%以上。

為定量測(cè)定病毒復(fù)制的核酸拷貝數(shù)，制備了熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其2為0.9983，引物的擴(kuò)增效率為103%。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)中和實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的病毒復(fù)制情況，結(jié)果顯示，病毒與卵黃抗體中和作用后接種CO細(xì)胞，于6、12、24、48和72 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的細(xì)胞培養(yǎng)物，測(cè)得的病毒RNA拷貝數(shù)均顯著低于病毒對(duì)照組 (圖4)，其中，第12小時(shí)中和實(shí)驗(yàn)組病毒拷貝數(shù)僅為病毒對(duì)照組的0.003倍。

圖1 大口黑鱸彈狀病毒的臨床癥狀(a)與PCR檢測(cè)結(jié)果(b)

1~3：病魚樣品Diseasedsamples；4：陰性對(duì)照Negative control；M：DNA Marker DL2000

圖2 大口黑鱸彈狀病毒在草魚卵巢細(xì)胞株(CO)上的病變情況

a：接種病毒2 d的CO細(xì)胞；b：正常的CO細(xì)胞

a: Cytopathic effect of CO cells 2 days post-infection; b: Normal CO cell monolayer

圖3 卵黃抗體的SDS-PAGE分析

1~3: IgY; M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein maker

圖4 卵黃抗體對(duì)彈狀病毒復(fù)制的影響

**表示差異極顯著(<0.01)，下同

** indicate highly significant differences, the same as below

2.4 卵黃抗體對(duì)CO細(xì)胞intelectin基因表達(dá)的影響

采用Real-time PCR方法檢測(cè)中和實(shí)驗(yàn)組及細(xì)胞對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)的CO細(xì)胞中基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，中和實(shí)驗(yàn)組基因的表達(dá)量在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于細(xì)胞對(duì)照組，其中，72 h時(shí)，中和實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量達(dá)到細(xì)胞對(duì)照組的10倍(圖5)。

圖5 卵黃抗體對(duì)CO細(xì)胞intelectin表達(dá)的影響

3 討論

近年來(lái)，大口黑鱸彈狀病毒在大口黑鱸苗種培育及養(yǎng)殖早期流行，嚴(yán)重時(shí)，80%池塘發(fā)病，死亡率高，短時(shí)間內(nèi)可高達(dá)90%，經(jīng)濟(jì)損失巨大。研究利用CO細(xì)胞分離培養(yǎng)大口黑鱸彈狀病毒，得到了較好的效果，病毒能在CO細(xì)胞上穩(wěn)定傳代，利用熒光定量PCR測(cè)定CO細(xì)胞培養(yǎng)的病毒RNA拷貝數(shù)，可達(dá)109copies/ml以上，收獲的細(xì)胞病毒液經(jīng)浸泡感染大口黑鱸魚苗，能復(fù)制出與自然發(fā)病魚相似的癥狀。目前，用于大口黑鱸彈狀病毒體外培養(yǎng)的細(xì)胞鮮有報(bào)道。Gao等(2018)利用大口黑鱸皮膚(LBS)細(xì)胞培養(yǎng)MSRV，可產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)，應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)，感染細(xì)胞24 h時(shí)病毒RNA相對(duì)表達(dá)量為感染6 h時(shí)的70多倍。在應(yīng)用CO細(xì)胞感染MSRV病毒時(shí)，檢測(cè)到感染24 h時(shí)病毒RNA相對(duì)表達(dá)量為6 h時(shí)的800倍以上，說(shuō)明，CO細(xì)胞較LBS細(xì)胞更適合MSRV的復(fù)制增殖。

卵黃抗體因具備無(wú)毒副作用和特異性高等特點(diǎn)，被廣泛用于人和動(dòng)物的疾病控制和治療(Zhen, 2008)。本研究發(fā)現(xiàn)，大口黑鱸彈狀病毒與特異性卵黃抗體作用后，在CO細(xì)胞中的復(fù)制水平明顯降低，說(shuō)明，特異性卵黃抗體對(duì)大口黑鱸彈狀病毒具有中和作用，但其抗體效價(jià)低于已報(bào)道的抗病毒卵黃抗體水平。王建梅等(2012)用鹽析法粗提制備的抗犬瘟熱卵黃抗體，其效價(jià)最高可達(dá)1∶819。張述斌等(2013)建立了一種用水稀釋反復(fù)凍溶法、氯仿萃取法與冷乙醇沉淀法相互結(jié)合提取雞新城疫卵黃抗體的方法，效價(jià)可達(dá)到1∶2048。雷丹等(2018)應(yīng)用水稀釋法提取抗豬流行性腹瀉病毒(PEDV)變異株卵黃抗體，其效價(jià)為1∶12800。分析本研究中卵黃抗體效價(jià)低的原因，可能是免疫程序和抗體提取純化方法不夠理想，還需進(jìn)一步優(yōu)化。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，5個(gè)時(shí)間點(diǎn)中和實(shí)驗(yàn)組病毒RNA拷貝數(shù)較病毒對(duì)照組下降水平不一，其中，12 h時(shí)下降1000倍，表明卵黃抗體除了可以直接中和病毒，還可能在病毒復(fù)制增殖過程中發(fā)揮作用，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

內(nèi)凝集素作為凝集素家族的一員，是一種新發(fā)現(xiàn)的分泌型凝集素。本研究中和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的表達(dá)水平較正常細(xì)胞組有所升高，提示，卵黃抗體在免疫防御或應(yīng)答方面發(fā)揮作用。李媛(2016)研究發(fā)現(xiàn)，遲緩愛德華氏菌()特異性IgY能夠增強(qiáng)大菱鲆()頭腎巨噬細(xì)胞的吞噬活性，刺激大菱鲆非特異性免疫相關(guān)酶(溶菌酶、超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶)的產(chǎn)生，還能增強(qiáng)這些酶的活性，也說(shuō)明，卵黃抗體具有刺激和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。目前，水生動(dòng)物有關(guān)的報(bào)道很少，Chang等(2007)報(bào)道，在草魚體內(nèi)經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)后表達(dá)水平顯著上調(diào)。Lin等(2009)報(bào)道，在感染殺鮭氣單胞菌()的肝臟中表達(dá)水平上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，草魚在接種草魚出血病滅活苗早期，腎臟中基因表達(dá)顯著上調(diào)(奕志娟等, 2015)。Chen等(2018)報(bào)道，斑馬魚()基因、和可以識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，從而能結(jié)合細(xì)菌并引發(fā)細(xì)菌的凝集。目前，尚未見卵黃抗體刺激基因上調(diào)的相關(guān)報(bào)道，其上調(diào)與病毒復(fù)制的相關(guān)性及其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

本研究成功建立了大口黑鱸彈狀病毒的體外培養(yǎng)和卵黃抗體制備方法，明確了卵黃抗體的抗病毒中和作用，為進(jìn)一步開發(fā)用于彈狀病毒免疫防治的免疫制劑奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Isolation and Egg-Yolk Antibody Preparation ofRhabdovirus

YUAN Xuemei, LV Sunjian, SHI Weida, HANG Xiaoying, LIU Li①, WU Yinglei

(Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Key Laboratory of Fish Health and Nutrition of Zhejiang Province, Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001)

The largemouth basshas been widely cultured in China due to its considerable economic value. Recently, the species suffered from seriousrhabdovirus (MSRV) disease during the juvenile phase, particularly in aquaculture conditions. In this study, a strain ofrhabdovirus isolated from dying juvenile fish was cultured in a grass carp ovary (CO) cell line. To take advantage of passive immunity, we explored anti-MSRV immunoglobin Y (IgY) by discontinuously immunization on laying hens with a formalin-killed vaccine of MSRV. The antibody was purified by saturated ammonium sulfate, and displayed virus resistance with an ELISA antibody titer of 1∶256 detected. The bioactivity of anti-MSRV IgY was tested simultaneously after being added to a CO cell line incubated with MSRV. This antibody showed antiviral activity, with 38.29% of neutralizing effectiveness detected at a dilution of 1∶64. The RNA copies of MSRV in the test group were clearly fewer in number compared with those of members of a control group. By the florescent real-time quantitative PCR, the intracellular lectin experienced significantly up-regulated pick-up to nearly 10-fold at 72 h compared with the control group. In conclusion, we successfully isolated a strain of MRSV and cultured it in a CO cell line. Anti-MSRV IgY prepared with vaccinations of inactive virus displayed antiviral activity in this study, laying a foundation for the application of yolk antibodies as an immune preparation.

; Rhabdovirus; Egg-yolk antibody; Virus neutralization

LIU Li, E-mail: liuli6655@hotmail.com

* 湖州市自然科學(xué)資金項(xiàng)目(2018YZ09)和浙江省省屬科研院所扶持專項(xiàng)項(xiàng)目(2019YSZX002)共同資助 [This work was supported by Natural Science Foundation of Huzhou City of China (2018YZ09), and Scientific Research Institution Support Special Project of Zhejiang Province (2019YSZX002)]. 袁雪梅，E-mail: 179506607@qq.com

劉 莉，研究員，E-mail: liuli6655@hotmail.com

2019-07-04,

2019-07-30

S917.1

A

2095-9869(2020)03-0151-07

10.19663/j.issn2095-9869.20190704001

http://www.yykxjz.cn/

袁雪梅, 呂孫建, 施偉達(dá), 杭小英, 劉莉, 吳穎蕾. 大口黑鱸彈狀病毒的分離培養(yǎng)及其卵黃抗體的制備. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(3): 151–157

Yuan XM, Lv SJ, Shi WD, Hang XY, Liu L, Wu YL. Isolation and egg-yolk antibody preparation ofrhabdovirus. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(3): 151–157

(編輯 馬璀艷)