日本沼蝦養殖過程中氨基脲存在特征研究

舒秀君，程 波，徐娟娟，熊貽偉，宋 蓓，宋 懌，韓 剛，蔣速飛

(1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院質量與標準研究中心，農業農村部水產品質量安全控制重點實驗室，北京 100141； 3.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，江蘇無錫 214081)

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)又名青蝦或河蝦，隸屬十足目(Decapoda)長臂蝦科(Palaemonidae)沼蝦屬(Macrobrachium)。在我國，日本沼蝦廣泛分布于江河、湖泊、池塘、河溝中，是我國淡水經濟蝦中的主要種類之一。隨著日本沼蝦在我國養殖和消費數量的增加，其產品的安全性也受到更多關注[1]。

氨基脲(Semicarbazide，SEM)是禁用藥物呋喃西林的主要代謝產物之一[2]。目前，國內外均以檢測SEM判斷是否在養殖過程中非法使用呋喃西林，其中，歐盟和我國將動物源性食品中SEM殘留的限量標準定為1.0 μg/kg[3，4]。研究表明，SEM來源廣泛[2，5-11]，且SEM可能是甲殼類水產品中的內源性物質[12-16]，以SEM作為判定甲殼類水產品是否非法使用呋喃西林藥物的監測指標并不合適[1，2，14-15，17-19]。有關甲殼類水產品中SEM的本底含量已有相關研究[1-2，4，18]，但大多限于個別樣品普查，且僅限于甲殼和肌肉2種組織[2，10-11，14-15]，而養殖生長過程中甲殼類動物體內SEM的存在特征、動態變化過程鮮有報道，養殖產品中SEM的科學監管依據不足。因此，本實驗以日本沼蝦作為研究對象，測定池塘養殖日本沼蝦不同生長時期SEM的存在特征與變化規律，以期為甲殼類水產品SEM限量標準的修訂和產地水產品質量安全監督抽查的科學實施提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、養殖條件與管理

實驗于2018年7-9月在中國水產科學研究院淡水漁業研究中心大浦基地進行。隨機選定其中一個池塘(面積32 000 m2，水深1.2 m)，2017年底在該池塘投放日本沼蝦“太湖1號”親蝦，2018年5月開始自然繁殖并孵化出蚤狀幼體，隨后在池塘中自然生長。生產管理上，5月份蚤狀幼體階段主要采用潑灑豆漿等肥水方法培養輪蟲等天然餌料；6月份大部分蚤狀幼體變態為幼蝦時，開始投喂日本沼蝦0號顆粒飼料(南通正大)，每日2次；隨著日本沼蝦的生長，8月份改投喂日本沼蝦1號顆粒飼料(江蘇冠乾)，每日2次，養殖過程持續到9月底。養殖生產期間，不使用任何含呋喃西林成分藥品。

1.2 實驗設計

考慮日本沼蝦組織取樣的可行性，本研究以日本沼蝦約達稚蝦規格階段開始作為起始點，將2018年7月1日采集的第一批日本沼蝦定義為本研究初始，即0 d樣品，陸續從養殖池塘每隔10 d拖網采集一次日本沼蝦，依次類推定義為10、20、30、40、50、60、70 、80 d樣品，樣品采集過程覆蓋日本沼蝦幼蝦至成蝦的主要養殖生長階段。每次采集約1 kg日本沼蝦，共采集9個批次。樣品采集后，在冷藏條件下6 h內運回實驗室，并于當天隨機選擇30尾進行體長和體重測量。

所有樣品用純水沖洗干凈后進行解剖，分別采集不同組織，其中前4次日本沼蝦樣品(即0～30 d)因個體較小，僅采集肌肉、甲殼和頭胸部3種組織，后4次日本沼蝦樣品(即40～80 d)分別采集肌肉、甲殼、附肢、肝胰腺、鰓和眼柄6種組織。所采集的肌肉、甲殼、附肢和頭胸部樣品用粉碎機(九陽 JYL-C010)充分破碎，肝胰腺和鰓樣品置于離心管中用剪刀充分剪碎，眼柄樣品用研缽充分磨碎，分別制成均質樣品后，在-20 ℃冷凍條件下保存待測。

1.3 SEM的測定

樣品中SEM的測定采用參照農業部783號公告-1-2006《水產品中硝基呋喃類代謝物殘留的測定液相色譜-串聯質譜法》優化后的方法[20]，進行總SEM(游離態SEM和結合態SEM之和)和游離態SEM的含量測定。每個樣品做3個平行樣。池塘水體和養殖飼料經檢測，均不含SEM成分。

1.4 方法檢出限與質量控制

通過加標回收的方式，進行質量控制。根據SEM在日本沼蝦各組織中的本底含量，添加水平為1.0～120 μg/kg。各組織中總SEM和游離SEM回收率在74.3%～113.5%之間，方法檢出限為0.25 μg/kg(S/N≥3)，定量限為0.5 μg/kg(S/N≥10)。

1.5 數據統計及分析

2 結果與分析

2.1 不同生長時期日本沼蝦的體重和體長

實驗期間日本沼蝦的平均體重和體長情況如圖1所示。實驗開始時，日本沼蝦平均體重為(0.41±0.19)g，體長為(3.31±0.59)cm，隨著養殖過程進行，體重和體長整體呈現增長趨勢，且在第3～6次采樣期間生長速度最快。實驗后期，生長速度相對放緩。在最后一次采樣時，日本沼蝦的平均體重為(2.16±0.66)g，體長為(6.00±0.52)cm。

圖1 實驗期間日本沼蝦體重和體長變化情況Fig.1 Variations of mean body weigth and mean body length of M.nipponense during the experiment

2.2 不同生長時期日本沼蝦各組織中總SEM含量水平及分布特征分析

不同生長時期日本沼蝦各組織中總SEM含量結果見表1。由表1可見，日本沼蝦在80 d養殖不同采樣時期內，肌肉中均存在總SEM，含量范圍為(6.88±0.15)～(17.11±0.62)μg/kg。隨著生長過程進行，肌肉中總SEM含量逐漸降低，從初始最高值(17.11±0.62)μg/kg降低至70 d時最低值(6.88±0.15)μg/kg，在第80 d含量略有回升。甲殼中均存在總SEM，含量范圍為(107.30±1.10)～(306.09±8.69)μg/kg。隨著生長過程進行，甲殼中總SEM含量呈現總體上升局部下降的變化趨勢，實驗前10 d內降低至最低值(107.30±1.10)μg/kg，隨后逐漸升高，在第30 d波動較大，40～80 d持續上升并在80 d達最大值。實驗期間前30 d內頭胸部中均存在總SEM，含量范圍為(100.29±1.21)～(116.15±2.67)μg/kg，波動幅度較小。第40～80 d內，附肢、眼柄、鰓和肝胰腺中均存在總SEM，其中，附肢中含量范圍為(243.90±8.55)～(532.31±26.27)μg/kg，隨著養殖過程進行，含量逐漸增加并在80/表示無樣品。

表1 不同生長時期日本沼蝦中總SEM的含量水平Tab.1 Concentration of total SEM in M.nipponense of different growth stages

d達最大值；眼柄中含量范圍為(85.27±3.19)～(122.82±2.60)μg/kg，隨著養殖過程進行，含量呈現整體增加局部波動的變化趨勢；鰓中含量范圍為(48.43±2.13)～(85.60±1.33)μg/kg，隨著養殖過程的進行，含量在第60 d時小幅增加，70 d時明顯下降并達到最小值，80 d時又明顯上升并達最大值；肝胰腺中含量范圍為(13.51±1.15)～(25.94 ±1.78)μg/kg，隨著養殖過程進行，在40～60 d期間肝胰腺中總SEM含量逐漸增加，在70 d時下降并達到最小值，80 d時又明顯增加。

由表1可知，在0～30 d內，甲殼、頭胸部和肌肉中總SEM的平均含量分別為(174.04±57.04)、(109.86±6.68)和(15.56±1.79)μg/kg，日本沼蝦幼蝦各組織中總SEM呈現：甲殼>頭胸部>肌肉的含量分布特征。在40～80 d內，附肢、甲殼、眼柄、鰓、肝胰腺和肌肉中總SEM的平均含量分別為(377.16±102.09)、(249.36±42.56)、(97.03±14.18)、(59.86±14.66)、(20.39±4.87)和(9.67±1.58)μg/kg，日本沼蝦成蝦各組織中總SEM呈現：附肢>甲殼>眼柄>鰓>肝胰腺>肌肉的含量分布特征。

2.3 日本沼蝦各組織中SEM的存在形態

如圖2所示，不同生長時期日本沼蝦肌肉和肝胰腺中SEM主要以游離態形式存在，游離態SEM在肌肉中所占比例為45.84%～83.51%，在肝胰腺中所占比例為56.99%～92.47%。甲殼、眼柄、附肢、頭胸部和鰓等組織中SEM主要以結合態形式存在，結合態SEM在甲殼中所占比例為85.01%～92.79%；在眼柄中所占比例為85.36%～90.34%；在附肢中所占比 例為83.55%～89.79%；在頭胸部中所占比例為75.46%～88.40%；在鰓中所占比例為68.01%～78.29%。

圖2 不同生長時期養殖日本沼蝦各組織的SEM形態組成Fig.2 SEM composition of tissues of cultured M.nipponense from different growth stages

3 討論

3.1 不同生長時期日本沼蝦中SEM的含量水平及其變化特征

水產品中SEM殘留通常認為是在養殖過程中非法使用呋喃西林后代謝產生。本研究結果顯示，養殖過程不同時期日本沼蝦中均檢出SEM，且含量均超過我國限量要求(1.0 μg/kg)。養殖過程中無人為使用硝基呋喃類禁用藥物的行為，池塘水體和所用飼料經檢測均不含SEM成分，但日本沼蝦中SEM含量超標，這與前人研究結果一致[2,4,14-15,18,20]。

本研究中日本沼蝦肌肉、甲殼和頭胸部總SEM的含量范圍與于慧娟等[2]和Hui等[1]研究結果一致，但與王鼎南等[4]和宋蓓等[20]結果有所差異，可能與不同研究所采集樣本處于不同生長時期有關。日本沼蝦在養殖過程中具有不斷繁殖的生物學特性，在不同時間點采樣，采集到不同批次孵化日本沼蝦的可能性較大，從而對實驗結果存在一定影響。隨著養殖過程的進行，日本沼蝦各組織中總SEM含量變化無明顯規律。其中，肌肉中總SEM含量逐漸降低，且在20～50 d之間降低速度最快，可能與日本沼蝦肌肉生長有關。在此期間日本沼蝦體重增長最快，而體重增長最主要貢獻來自于肌肉增長，導致SEM含量被“稀釋”而降低。甲殼中總SEM含量逐漸增加，并在40 d時明顯降低，這可能與日本沼蝦蛻皮過程有關。在此期間日本沼蝦體重和體長增長最快，而日本沼蝦的生長必然伴隨蛻皮過程，但甲殼中SEM是否會隨著蛻皮而排出體外，或SEM在蛻皮過程中是否發揮了某種生物學作用，值得進一步研究。附肢中總SEM含量在實驗40～80 d期間變化規律與甲殼中變化規律較為一致，可能與附肢主要由甲殼和肌肉組成，而甲殼中含量遠高于肌肉，因此，甲殼中SEM含量變化特征主導了附肢中SEM含量變化的結果。

3.2 不同生長時期養殖日本沼蝦中SEM的含量分布特征與存在形態

在實驗0～30 d內，養殖日本沼蝦幼蝦各組織中總SEM呈現：甲殼>頭胸部>肌肉的含量分布特征，這與Hui等[1]的研究結果一致。在實驗40～80 d內，養殖日本沼蝦成蝦各組織中總SEM呈現：附肢>甲殼>眼柄>鰓>肝胰腺>肌肉的含量分布特征，附肢中總SEM平均含量最高，這與課題組前期探索研究不一致[20]。按照結構組成，附肢主要由甲殼和肌肉等組成，總SEM在附肢中的含量應介于甲殼和肌肉之間，為何附肢中含量最高，有待進一步深入研究。彭婕等[21]對中華絨螯蟹不同組織中SEM進行分析，發現除蟹殼外，肌肉、肝胰腺、鰓及性腺中均無SEM檢出。于慧娟等[2]對三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)、鋸緣青蟹(Scyllaserrata)、珍寶蟹(DungenessCrab)、中國鱟(Tachypleustridentatus)等甲殼類動物的研究中，也僅在甲殼中檢測出不同含量SEM成分。可見，SEM在不同甲殼動物中分布特征不同，但甲殼均是SEM存在與含量較高的組織。

在形態組成上，SEM在日本沼蝦肌肉和肝胰腺中主要以游離態形式存在，游離態SEM所占平均比例分別為67.35%和72.40%，在甲殼、眼柄、附肢、頭胸部和鰓中主要以結合態形式存在，結合態SEM所占平均比例分別為89.50%、87.16%、85.68%、80.48%和73.30%。肌肉和甲殼中SEM的存在形態與王鼎南等[4]和Christof等[14]的研究結果一致，而眼柄、附肢、頭胸部和鰓等組織，此為第一次報道，缺乏可比較研究。另外，由于日本沼蝦肌肉中SEM含量相較其他組織含量最低，且主要以游離態形式存在，本研究選擇了前期研究[20]優化的SEM檢測方法，通過測量含量相對較高的游離態SEM方法，而非直接檢測含量處于檢測限的結合態SEM，從而進行SEM形態分析，最大程度避免了因檢測含量低導致檢測誤差或檢不出的問題。