miR-93-3p和CDC42在上皮性卵巢癌化療耐藥組織中的表達及臨床意義

楊雷 魏麗軍 王福花 曾勇

1山西醫科大學第二臨床醫學院（太原030013）；山西醫科大學附屬腫瘤醫院2婦一科，

3分子生物室（太原030013）

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一。由于卵巢位于盆腔深部，早期卵巢癌發病無明顯癥狀且無特異性的腫瘤標記物進行診斷，大多數卵巢癌患者初次診斷即為晚期。而且卵巢癌易復發和化療耐藥，使得晚期卵巢癌患者5年生存率低于30%[1]。目前卵巢腫瘤細胞減滅術聯合化療是治療卵巢癌的重要手段，而順鉑等鉑類藥物是目前卵巢癌一線化療藥物[2]。患者預后很大程度上取決于是否對鉑類化療藥物敏感。由于部分患者對化療藥物耐藥而導致化療失敗，從而縮短生存期。上皮性卵巢癌為卵巢癌中最為常見的類型（占80%～85%）。上皮性卵巢癌相關基因表達異常是導致化療耐藥的重要因素之一。因此近年來卵巢癌化療耐藥相關基因也成為上皮性卵巢癌研究的熱點。

在筆者前期研究[3]中利用miRNA表達譜基因芯片技術篩選出與上皮性卵巢癌化療耐藥相關低表達量的miR-93-3p。在此基礎上，應用兩種生物信息學軟件預測miR-93-3p 可能的靶基因，結合文獻分析靶基因可能參與上皮性卵巢癌化療耐藥的生物學過程及信號通路。本研究采用RT-PCR 技術檢測miR-93-3p和CDC42在上皮性卵巢癌組織中的表達，比較上皮性卵巢癌化療敏感和化療耐藥組織中的表達水平。探討miR-93-3p在上皮性卵巢癌化療耐藥中可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2015年8月至2018年7月間就診于山西省腫瘤醫院111例上皮性卵巢癌患者的組織學標本。根據NCCN 公布的卵巢癌臨床實踐指南，將患者分為鉑類化療敏感組與耐藥組。其中鉑類化療敏感組44例，耐藥組67例。患者年齡35～62歲，耐藥組平均年齡49.9歲，敏感組平均年齡51.1歲。將鉑類化療敏感組定義為對照組。上皮性卵巢癌化療耐藥定義標準：腫瘤細胞減滅術后對初次化療有反應，但完成化療后相對較短的時間通常6個月內復發者；上皮性卵巢癌化療敏感定義標準：腫瘤細胞減滅術后對初次化療有明確反映，并達到臨床完全緩解，停用化療藥6個月后復發者。上皮性卵巢癌復發的證據和跡象：（1）CA125水平升高；（2）出現胸、腹水；（3）體檢發現腫塊；（4）影像學檢查發現腫塊；（5）不明原因腸梗阻。存在上述兩項或兩項以上指標即可考慮為上皮性卵巢癌復發。納入實驗標準為：（1）患者年齡35～62歲；（2）無其他惡性腫瘤病史；（3）術前均未接受任何抗腫瘤藥物治療且未行其他輔助治療；（4）接受卵巢癌細胞減滅術后經病理學證實為上皮性卵巢癌并在術后完整規范接受紫杉醇聯合鉑類藥物化療患者。所有組織標本取出后0.5 h 內置于的凍存管中，液氮冷凍保存備用。本研究經山西醫科大學附屬山西省腫瘤醫院倫理委員會批準（批準文號：201507），受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑TaqMan Real-time PCR miRNA Array、SYBR?Select Master Mix，購自ABI公司；RNAiso Plus，購自TaKaRa公司；the First Strand cDNA Synthesis Kit，購自Tiangen?公司。

1.3 方法

1.3.1 miR-93-3p靶基因預測及功能、生物學通路分析通過miRD、mirTarbas 等生物信息學分析軟件對miR-93-3p 進行靶基因預測分析，選取2種軟件共同結果作為其可能靶基因，并對每個micro RNA所有靶基因在DAVID 網站進行KEGG和功能通路分析（P＜0.05）。

1.3.2 實時熒光定量PCR檢測（1）運用RNAiso Plus，在無RNase 條件下提取卵巢癌組織總RNA。使用Nanodrop2000c 分光光度儀進行RNA濃度及純度的測定，測量到260 nm和280 nm的吸光度值的比值（OD260/OD280）均在1.8～2.0間，用于進一步實驗。（2）使用the First Strand cDNA Synthesis kit，將總RNA反轉錄成cDNA。反應條件：25℃10 min，37℃120 min，85℃5 min。（3）將合成的cDNA 作為定量PCR 模板，按照miScript SYBR Green PCR Kit 反轉錄試劑盒的說明對cDNA 實施RT-PCR 擴增。用20 μL反應體系，標本使用U6作為內參。擴增反應條件：95℃5 min，95℃45 s，60℃30 s，40 cycles。每一樣本PCR 反應重復3次。miR-93-3p 引物序列：上游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；下游5′-ACUGCUGAGCUAGCACUU-3′。CDC42 引物序列：上游5′-CCATCGGAATATGTACCGACTG-3′；下游：5′-CTCAGCGGTCGTATCTGTCA-3′。

1.4 統計學方法應用SPSS 24.0 對PCR 數據進行統計分析。每個樣品目的基因的ΔCt 值用內參基因進行處理（ΔCt=Ct目的基因-CtU6，U6為內參，隨后對化療敏感組ΔCt 取平均值，記為ΔCt敏感均值。ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt敏感均值），最后計算樣品目的基因相對表達量即2-ΔΔCT。化療耐藥組織及化療敏感組織數據采用t檢驗分析比較，數據以表示。miR-93-3p和CDC42的相關性采用Spearman 相關性檢驗。

2 結果

2.1 miR-93-3p靶基因預測及生物信息學分析對miR-93-3p 通過2個數據庫（miRD，mirTarbas）預測靶基因信息，把2個數據庫的預測結果取交集作為預測結果，可以降低預測靶基因的假陽性率。運用2種生物信息學軟件分析預測到miR-93-3p 可能的靶基因有ACTB，CDC42，ENAH，MAP2K1，PNMA5，ING3，ABR 等126個。通過靶基因GO 功能注釋分析發現：miR-93-3p 預測到靶基因參與的生物學過程主要富集在RNA 代謝過程調節、細胞分化、轉錄調節、蛋白質結合等方面（P＜0.05）。通過靶基因KEGG 信號轉導通路分析發現：miR-93-3p 靶基因顯著富集在焦點粘連、癌癥通路、蛋白質分解等基因通路（P＜0.05）。結果見圖1、2。結合藥物代謝及化療耐藥相關理論和相關文獻，并將生物學過程中所包含的靶基因與信號通路中所包含的靶基因取交集，CDC42 可能通過miR-93-3p的調控Focal adhesion 信號通路參與上皮性卵巢癌化療耐藥。

圖1 miR-93-3p 預測靶基因GO 功能注釋分析Fig.1 GO function annotation analysis of miR-93-3p predictive target gene

圖2 miR-93-3p 靶基因KEGG 通路富集分析Fig.2 KEGG pathway enrichment analysis of miR-93-3p target genes

2.2 RT-PCR檢測上皮性卵巢癌組織中miR-93-3p和CDC42的表達水平

2.2.1 實時定量PCR檢測miR-93-3p、CDC42和U6內參的擴增曲線和溶解曲線miR-93-3p、CDC42和U6 內參擴增曲線呈S型，曲線光滑，拐點清楚（圖3、5）；miR-93-3p、CDC42和U6 內參溶解曲線呈單峰，提示擴增的特異性較好，結果可信（圖4、6）。

2.2.2 miR-93-3p、CDC42在化療耐藥和敏感組織中的表達水平比較實時熒光定量PCR檢測結果顯示，miR-93-3p在化療耐藥組中的相對表達量顯著低于敏感組，差異具有統計學意義（P＜0.05，表1）。CDC42在化療耐藥組中的相對表達量顯著高于敏感組，差異具有統計學意義（P＜0.05，表1）。

圖3 miR-93-3p和U6 內參擴增曲線Fig.3 miR-93-3p and U6 internal parameter amplification curves

2.3 miR-93-3p、CDC42表達量與上皮性卵巢癌患者臨床病理參數的關系按照上皮性卵巢癌患者不同臨床特征對研究對象進行分組，miR-93-3p在臨床分期中的表達量隨著期別升高呈現明顯下調，CDC42的表達量隨著期別升高呈現明顯上調（P＜0.05）。miR-93-3p在不同的組織學分級中，隨著分級升高，腫瘤惡性程度增加，miR-93-3p表達水平呈現明顯下調，而CDC42表達水平呈現明顯上調（P＜0.05）。有淋巴轉移及無淋巴轉移組中，miR-93-3p的表達在淋巴轉移組較淋巴無轉移組明顯下調，CDC42的表達在淋巴轉移組較淋巴無轉移組明顯上調（P＜0.05）。而與年齡無明顯相關（P＞0.05）。見表2。

圖4 miR-93-3p和U6 內參溶解曲線Fig.4 The Melt curves of miR-93-3p and U6

圖5 CDC42和U6 內參擴增曲線Fig.5 CDC42 and U6 internal parameter amplification curves

圖6 CDC42和U6 內參溶解曲線Fig.6 The Melt curves of CDC42 and U6

表1 miR-93-3p、CDC42在化療耐藥和敏感組織中的表達水平比較Tab.1 Comparison of expression levels of miR-93-3p and CDC42 in chemotherapy-resistant and sensitive tissues（n=111）±s

表1 miR-93-3p、CDC42在化療耐藥和敏感組織中的表達水平比較Tab.1 Comparison of expression levels of miR-93-3p and CDC42 in chemotherapy-resistant and sensitive tissues（n=111）±s

組別敏感組耐藥組miR-93-3p 2-ΔΔCT 1.303±1.000 0.075±0.052 P 值0.023 CDC42 2-ΔΔCT 1.069±0.447 1.704±0.705 P 值0.017

表2 上皮性卵巢癌組織miR-93-3p、CDC42 相對表達量與部分臨床病理參數的關系Tab.2 Relationship between relative expressions of miR-93-3p and CDC42 in epithelial ovarian cancer tissues and some clinicopathological parameters±s

表2 上皮性卵巢癌組織miR-93-3p、CDC42 相對表達量與部分臨床病理參數的關系Tab.2 Relationship between relative expressions of miR-93-3p and CDC42 in epithelial ovarian cancer tissues and some clinicopathological parameters±s

注：G1級為高分化，惡性度相對較低；G3為低分化，惡性度高；N1組為有淋巴結轉移，N0組為無淋巴結轉移

病理參數年齡＜50≥50臨床分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ組織學分級G1 G2 G3淋巴結轉移N1 N0例數53 58 61 50 16 34 61 60 51 miR-93-3P 1.36±0.56 1.34±1.02 1.47±1.70 1.16±1.47 1.33±1.22 1.07±0.71 0.12±0.22 0.28±0.54 1.05±1.56 P 值0.323 0.031 0.028 0.001 CDC42 0.38±0.17 0.36±0.25 0.31±0.03 0.91±0.47 0.21±0.13 0.81±0.37 0.95±0.23 0.88±0.36 0.45±0.41 P 值0.562 0.043 0.001 0.037

2.4 miR-93-3p與CDC42表達的相關性111例卵巢癌患者組織中miR-93-3p與CDC42表達經Spearman 相關性分析顯示，miR-93-3p與CDC42表達水平呈負相關（r=-0.469，P＜0.01）。

3 討論

miRNA是非編碼RNA 家族的成員之一，長度約20～25個核苷酸，在真核生物中首次被發現[4]，以往認為miRNA 無生物學功能。當前研究[5]發現，人類各種類型腫瘤發生與miRNA的異常表達相關。miRNA 能夠通過控制其靶mRNA的表達來促進腫瘤的生長、侵襲、血管生成和免疫逃避，調控靶基因的表達[6-7]。miRNA與靶基因的3′端非翻譯區互補結合后，發揮轉錄后水平的調節作用，并且同時調控多個目標基因，此為miRNA 作用廣泛的重要機理[8]。與腫瘤相關的miRNAs 被分為兩類：抑癌miRNAs和促癌miRNAs[9]。抑癌miRNAs表達量減少，其所調控的下游靶基因表達量增加，下游基因一般為致癌基因。相反，促癌miRNAs 一般表達量增多，其調控的下游靶基因表達量減少，一般為抑癌基因。盡管如此，有關人類miRNAs 異常表達導致惡性腫瘤發生發展的研究才剛剛開始，這是因為一個miRNA 可以同時調控多個靶基因，一個靶基因也可以被多個miRNA 調控，miRNA與靶基因之間形成了復雜的關系。

研究[10-11]表明，在卵巢癌患者中，參與不同卵巢癌通路的miRNA表達是上調或下調的。miRNA在不同組織類型的卵巢癌的發病機制和發生過程中都發揮著重要作用。miR-93屬于miR-106b-25家族成員，miR-93-3p 屬于miR-93的亞型。有研究[12]發現miR-93 可抑制腫瘤細胞侵襲轉移能力，并且負向調控靶基因表達，抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移過程。miR-93在非小細胞肺癌和彌漫性大B 細胞淋巴瘤中表達上調，而在胃癌組織中則表達降低，說明不同腫瘤組織中miR-93的作用和分布均存在較大差異[13]。XIANG 等[14]研究了在人結腸癌干細胞中不同miRNA的表達，結果顯示，miR-93會抑制SW1116 干細胞增值，屬于抑癌基因。在SRIVASTAVA 等[15]研究中，從卵巢癌細胞分離出的miR-93表達水平下降，且與鉑類化療耐藥相關。有研究[16]表明，miR-93-3p 通過靶向促進FZD7的表達，激活Wnt/β-catenin 信號通路，促進骨肉瘤的進展。迄今為止，miR-93-3p在上皮性卵巢癌化療耐藥中的作用還不清。筆者前期運用miRNA表達譜基因芯片技術分析發現miR-93-3p在上皮性卵巢癌化療耐藥組織中低表達。本研究結果顯示，miR-93-3p 相對于化療敏感組，在鉑化療耐藥組中的表達量顯著下調；在臨床分期中的表達，隨著期別升高其表達水平卻呈現明顯下降；組織學分級中，隨著腫瘤惡性程度增加，miR-93-3p表達量明顯下降；在淋巴結轉移組中的表達水平較無淋巴結轉移組表達水平明顯下降。說明miR-93 低表達可能在卵巢癌化療耐藥過程中可能發揮抑癌基因的作用。

筆者利用生物信息學軟件預測到miR-93-3p可能的126個靶基因，進一步對預測到的靶基因進行GO 分析和KEGG Pathway 分析，GO 分析結果顯示小的GTPase 介導的信號轉導、正調控RNA 聚合酶Ⅱ轉運過程與化療耐藥相關。KEGG Pathway分析結果顯示FAK 信號通路可能與上皮性卵巢癌化療耐藥發生相關。FAK是一種分子量125 kD的非受體、非膜性的胞質酪氨酸蛋白激酶，主要位于黏附細胞的黏著斑，主要在細胞質中表達，其在進化上高度保守，并在調節細胞生存、黏附、凋亡中發揮重要作用。在細胞癌變過程中，FAK 活化，并通過自動磷酸化后激活下游信號通路，促進細胞的增殖和遷移[17-18]。有研究[19]表明，宮頸癌標本中FAK 被激活，而宮頸細胞、宮頸炎細胞中FAK 未被激活，激活的FAK與宮頸癌患者臨床預后不良相關，特別是FAK 基因可通過抑制腫瘤細胞凋亡而起到促腫瘤的作用。本研究中筆者通過生物信息學軟件預測到可能的靶基因CDC42 參與FAK 信號通路，因此選擇CDC42 作為接下來的研究方向。CDC42是Rho 家族的一種小GTP 酶，全長191個氨基酸，促進細胞分裂和生長，包括細胞周期進展、轉錄、肌動蛋白細胞骨架組織和膜運輸等[20]。CDC42 除參與正常的細胞生理過程外，與腫瘤的發生、侵襲和轉移密切相關[21]，CDC42 可以增強細胞間的黏附，促進細胞骨架構建和腫瘤血管壁生成，阻斷正常凋亡信號轉導途徑從而抑制凋亡。在消化系統腫瘤、頭頸部腫瘤、黑色素瘤等惡性腫瘤中表達增高[22]。在體內成像觀察和侵入性研究表明偽足在腫瘤侵襲和轉移中起主要作用[23]。有研究[24]表明，miR-924在肝癌細胞株中表達下調，當miR-924在肝癌細胞中過表達后，可靶向調控CDC42 抑制細胞的增殖和遷移。LIU 等[25]研究發現經過化療后殘存的乳腺癌衰老細胞可表現出對內分泌藥物的耐藥性。進一步研究發現乳腺癌衰老細胞中CDC42 高表達，CDC42在乳腺癌衰老細胞中通過激活ERK 信號通路增加對內分泌藥物的耐藥性。本研究中，筆者發現CDC42在上皮性卵巢癌鉑類化療耐藥組中顯著高表達，且高表達量的CDC42與上皮性卵巢癌臨床分期、組織學分級、淋巴轉移有顯著相關性。miR-93-3p和CDC42的表達呈負相關。表明高表達的CDC42與上皮性卵巢癌惡性程度及遷移有關。

綜上所述，miR-93-3p 低水平表達可能與上皮性卵巢癌的發生發展有關，并在上皮性卵巢癌化療耐藥中產生作用。miR-93-3p 可能通過調節靶基因CDC42 參與上皮性卵巢癌鉑類化療耐藥過程。