基于GEO數據庫對結腸癌BMI1基因篩選及其對人結腸癌細胞增殖及侵襲遷移機制研究

盧敏 鄭相濤 毛華 沙衛紅

1南方醫科大學珠江醫院消化內科（廣州510282）；2南方醫科大學第二臨床醫學院（廣州510282）；3廣東省人民醫院消化內科，廣東省醫學科學院（廣州510080）

據2018年全球癌癥統計數據，結腸癌是導致癌癥死亡的第四大原因［1］。結直腸癌的復發和轉移是預后不良和導致高病死率的重要因素。BMI1基因在結直腸癌中高度表達［2］，且BMI1 參與癌細胞增殖、侵襲、遠處轉移。然而，通過生物信息學分析對結腸癌差異表達的BMI1 基因研究較少，且其參與結腸癌增殖和轉移的機制尚不清楚。本研究基于GEO 數據庫獲取結腸癌基因芯片數據，對結腸癌生存預后進行生物信息學分析，尋找結腸癌治療的靶基因BMI1，并通過RNA 干擾技術檢測干擾靶基因后對人結腸癌細胞增殖、侵襲和轉移力的影響及作用機制，為結腸癌的治療新靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑胎牛血清（FBS，Hyclone），培養基（DMEM，Gibco），脂質體Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國），transwell 小室（costar，美國），matrigel膠（BD，美國）。 SYBR RT PCR Kit 為TaKaRa 生物科技有限公司產品，BMI1、P16ink4a、E-cadherin、Vimentin 一抗均為美國Abcam 公司Santa cruz 公司產品。

1.2 生物信息學分析在GEO數據庫下載GSE50760序列號相關的結直腸癌信息；收集了結直腸癌原發癌組織、轉移瘤組織以及正常組織各18 例。另外通過Oncomine 數據庫收集結直腸癌相關的資料。（篩選條件：（1）cancer type：colorectal cancer；（2）gene：BMI1；（3）data type：mRNA 或DNA；（4）analysis type：cancer vs normal analysis）。利用R 軟件及相關軟件包對GSE50760 表達譜數據進行過濾及標準化，篩選差異基因。差異基因篩選標準：|logFC|≥2，校正后P＜0.05。同時繪制差異表達基因熱圖及火山圖，分析BMI1 表達與結直腸癌預后的關系，當P＜0.05 為差異有統計學意義。

1.3 細胞培養LOVO 結腸癌細胞株由南方醫科大學消化疾病研究所贈送。將細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱，含10%胎牛血清的DMEM 培養基中培養。

1.4 細胞轉染靶向敲除BMI1 mRNA（siBMI1）的三對siRNA 序列由蘇州吉瑪生物科技有限公司（中國上海）合成。將LOVO 細胞用胰蛋白酶消化并接種到24 孔板中，細胞密度為105個細胞/孔，每個孔添加不含抗生素的培養基500 μL，直到細胞在轉染時達到70%～80%匯合。細胞轉染時使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）進行轉染，同時用熒光標記的FAM-siRNA 評估轉染效率。

1.5 實時定量PCR轉染后48 h，用Trizol 從細胞中提取RNA，然后進行逆轉錄和實時PCR（RT-qPCR）以檢測BMI1 mRNA 表達情況并篩選出具有最大抑制效率的siBMI1。使用SYBR?PremixEx Taq TM（Takara）試劑盒進行qPCR 檢測。本研究中使用的BMI1 基因的引物序列如下所示：有義鏈5′GCCAACAGCCCAGCAGGAGG3′，反義鏈：5′TTGGTGGTTACCGCTGGGGC3′。擴增的長度為203 bp。PCR 循環為95 ℃30 s，39 個循環，95 ℃5 s 和60 ℃30 s。所有樣本重復3 次；將β-catenin 作為內參，使用2-ΔΔCt方法計算表達水平。選取最有效的siRNA 序列用于以下實驗。

1.6 CCK-8 檢測細胞增殖能力將LOVO 細胞懸液分別接種在96 孔板中培養約24 h 后進行細胞轉染，分別以特異性BMI1 的siRNA 序列（siBMI1組）和非特異性siRNA 序列（NC 組）進行轉染，然后培養48 h 后。每孔加入10μL CCK-8 溶液，然后在37 ℃溫箱中繼續培養2 h。最后用分光光度計在450 nm 處讀取吸光度（OD值）。

1.7 Transwell 小室檢測細胞遷移能力使用transwell 小室遷移實驗檢測LOVO 細胞的侵襲性，將含有5 μL Matrigel 基底膜基質的transwell 小室置于24孔培養板中。將細胞分為2組：siBMI1組和陰性對照（NC）組。轉染后在24 h 和48 h 收集細胞，并以5 × 105個細胞/mL 的密度接種到transwell室中下室中加入完全培養基。24 h 和48 h 后取出transwell 小室，將細胞染色并在顯微鏡下計數。將細胞染成藍色，而聚碳酸酯膜孔顯示為黑點。實驗重復3 次。

1.8 流式細胞學檢測細胞周期變化結腸癌細胞也分為2 組：siBMI1 組和陰性對照（NC）組，轉染后在24 h 和48 h 收集細胞。然后用PBS 洗滌細胞兩次，用70%乙醇在冰上固定20 min，隨后用PBS洗滌3 次。然后，將細胞懸浮于含有0.2 mL RNase和0.5 mL PI 染色液的200 μL PBS 中，并在37 ℃下染色15 min，接著在流式細胞儀（FACSVerse；BD Biosciences，USA）上分析細胞。

1.9 Western Blot檢測從轉染siBMI1和scramble siRNA 轉染的LOVO 細胞中提取蛋白進一步檢測相關分子表達變化。細胞離心后收集沉淀并在冷的細胞裂解緩沖液中裂解。在4 ℃下離心10 min后，通過12%SDS-PAGE 分離上清液并轉移到硝酸纖維素膜上。將膜與封閉溶液（5%脫脂乳；Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO）在室溫下培養1 h，然后與下列一抗在4 ℃培養一夜：兔抗人BMI1 抗體（Abcam 公司，美國），兔抗人P16ink4a 抗體，兔抗人E-鈣粘蛋白抗體，兔抗人Vimentin 抗體（Santa cruz，美國）。接下來，用含有Tween-20（1 mL/L）的1X tris 緩沖鹽水洗滌膜，并與二抗一起溫育。 使用ECL 系統檢測膜上的抗體-抗原復合物，并用Image Pro Plus 軟件定量蛋白質條帶的相對強度。

1.10 統計學方法統計學分析采用SPSS 22.0 統計軟件（IBM，美國）和Graphpad prism 6.0 進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示。CCK-8細胞增值實驗，Transwell 細胞遷移實驗均采用兩獨立樣本t檢驗統計。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌差異基因篩選使用GEO 數據庫對GSE50760 表達譜數據進行分析，根據篩選標準篩選出差異基因，繪制結直腸癌組織樣本與正常組織樣本差異表達基因熱圖（圖1）以及火山圖（圖2）。通過Oncomine 數據庫分析，BMI1 在結直腸癌中的表達量高于正常組織（P＜0.05，圖3）。

2.2 BMI1在結直腸癌和正常組織之間的表達差異及其與預后的分析通過分析數據集GSE50760 中18 例結直腸癌患者原發癌、轉移癌及癌旁組織的BMI1 基因表達的豐度值，發現BMI1 在同一患者原發結直腸癌組織中的轉錄水平顯著高于其癌旁組織，而在同一患者轉移癌組織的轉錄水平顯著高于原發癌組織（P＜0.01，圖4）。通過生存分析發現，BMI1 的表達水平與結直腸癌患者生存預后之間存在相關性，高表達BMI1的患者總體病死率較高，低表達BMI1 的患者預后較好（P＜0.05，圖5）。

圖1 結直腸癌組織樣本與正常組織樣本差異表達基因熱圖Fig.1 Thermogram of differentially expressed genes between colorectal cancer and normal tissue samples

圖2 結直腸癌組織樣本與正常組織樣本差異表達基因的火山圖Fig.2 Volcanic map of differentially expressed genes between colorectal cancer and normal tissue samples

圖3 Oncomine 數據庫中關于BMI1 在結直腸癌總的表達Fig.3 The expression of BMI1 in colorectal cancer in Oncomine database

圖4 BMI1 蛋白在結直腸癌原發癌組織、轉移瘤組織及正常組織中的表達Fig.4 The expression of BMI1 protein in primary cancer，metastasis of colorectal cancer and normal tissues

圖5 數據集GSE50760 中BMI1 表達與結直腸癌預后之間的生存曲線Fig.5 The survival curve between BMI1 expression and colorectal cancer prognosis in GSE50760

2.3 選擇最大抑制效率的siBMI1 序列首先通過RT-PCR 評估了3 種siBMI1 的效能，發現第一種siBMI1 在LOVO 細胞中具有最強的抑制效率（約80%）。該siBMI1 的上游引物序列為5′GGAUCGGAAAGUAAACAAATT3′，下游引物序列為5′UUUGUUUUUUUCCGAUCCTT3′，見圖6。

圖6 BMI1 基因干擾抑制結腸癌細胞mRNA 的表達Fig.6 BMI1 gene interference suppresses mRNA expression by siRNA in colorectal cancer cells

2.4 BMI1 敲除抑制結腸癌細胞增殖通過CCK8測定細胞生長時間，BMI1 基因干擾后發現siBMI1顯著抑制了結腸癌細胞增殖（圖7）。

圖7 BMI1 敲除抑制結腸癌細胞的增殖Fig.7 BMI1 knockout inhibits proliferation of colorectal cancer cells

2.5 BMI1 敲除抑制人結腸癌細胞侵襲和遷移Transwell 小室遷移試驗確定BMI1 敲除對結腸癌細胞侵襲力的影響。與NC 組相比，siBMI1 組的遷移明顯較弱（307±12.12vs.181.33±8.14，P＜0.05，圖8）。表明BMI1 敲除可以抑制結腸直腸癌LOVO細胞的侵襲。

圖8 BMI1 敲除抑制結腸癌細胞的侵襲和遷移Fig.8 BMI1 knockout inhibits invasion and migration of colorectal cancer cells

2.6 BMI1 敲除抑制結腸癌細胞周期進展進一步通過流式細胞技術檢測BMI1 敲除對結腸癌細胞的細胞周期進程的影響。BMI1 敲除后，促使結腸癌細胞細胞周期中G1 期的停滯和S 期的縮短，因此BMI1 敲除可通過抑制癌細胞細胞周期來抑制癌細胞增殖（圖9）。

2.7 BMI1 敲除上調P16ink4a 表達并抑制EMT表達siBMI1 組中的BMI1 蛋白表達在轉染后48 h顯著低于NC組（P＜0.05）（圖10A、B）。降低的BMI1水平與siBMI1 組中P16ink4a 表達水平的增加相一致（P＜0.05）（圖10A、C）。進一步檢測EMT 相關的E-cadherin 和Vimentin 的表達。如Western 印跡所示（圖10A、D、E），在SiBMI1 轉染后，E-鈣粘蛋白表達增加，但波形蛋白表達降低。這些研究表明，BMI1 的敲除可能通過抑制EMT，上調E-鈣粘蛋白的表達和下調波形蛋白的表達，從而抑制LOVO 細胞的侵襲。

3 討論

圖9 BMI1 敲除抑制結腸癌細胞周期進展Fig.9 BMI1 knockout inhibits the progression of colorectal cancer cells cycle

圖10 BMI1 基因敲除對結腸癌細胞中P16INK4a 及EMT 表達的調節Fig.10 Regulation of P16INK4a and EMT expression by BMI1 gene knockout in colorectal cancer cells

結腸直腸癌是消化道的常見惡性腫瘤。國際癌癥研究機構2018年的最新報告顯示，結直腸癌的病死率在全球排名第4 僅次于肺癌、乳腺癌和前列腺癌［3］。結腸癌的侵襲和轉移是影響預后最重要的因素。因此，需積極尋找結腸癌治療的新方法。

HAUPT 等［4］首先在小鼠淋巴瘤中鑒定出BMI1基因，并證明BMI1 是一種關鍵的多梳蛋白，參與調節造血干細胞的增殖。同時發現BMI1 和c-myc基因共同引起細胞轉化和腫瘤發生［5］。BMI1 在許多惡性腫瘤中均有過表達，包括前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌和結腸癌［6-9］。在結直腸癌組織中，BMI1的表達水平顯著增加；并且與遠處轉移和TNM分期密切相關［9］。所有研究表明BMI1 是致癌基因，其沉默會抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。在本研究中，從GEO 數據庫下載結腸癌芯片數據GSE50760，分為癌組織和正常組織，利用GEO2R在線對其處理分析，結果發現，BMI1 在結腸癌組織中呈高表達，且BMI1 的表達水平與結直腸癌患者生存預后之間存在相關性。siRNA 可沉默轉錄后基因的表達水平，轉染48 h 后可抑制靶基因的表達。有研究［10］表明，利用小干擾RNA（siRNA）技術干擾酰基輔酶A 一膽固醇酰基轉移酶1（ACATl）基因在人結腸癌HT29 細胞中的表達，可抑制人結腸癌HT29 細胞增殖和侵襲遷移能力。在本研究中，用RNA 干擾技術將siBMI1 轉染至人結腸癌細胞，可有效抑制BMI1 的表達，從而進一步抑制癌細胞增殖遷移。

上皮-間質轉化（EMT）可促進結腸癌等惡性腫瘤的侵襲和轉移，有研究表明，BMI1 通過E-cadherin 的下調促進了結腸CSCs 的侵襲和遷移，這可能是由于EMT 增加所致［11］。然而，結腸癌細胞中BMI1 和EMT 之間確切機制尚不清楚。據報道，在子宮內膜癌細胞中，可以通過miRNA 靶向敲除PTEN 和其他EMT 相關基因（例如Twist1，ZEB1 和BMI1）來激活或減弱EMT和CSC［12］。此外，P16ink4a通過miR-141/miR146b-5p 抑制EMT。但結腸癌細胞中BMI1 是否通過P16ink4a 促進EMT 尚不清楚。

編碼自INK4a 基因的P16ink4a 可以滅活CDK，且與細胞周期調控密切相關［12］，P16ink4a 抑制視網膜母細胞瘤蛋白并使腫瘤細胞停止在G1/S期［14］。一些關于腫瘤進展的研究表明，P16ink4a是BMI1 的下游基因，其表達被BMI1 抑制［15］。本研究發現BMI1 敲除不僅增加了P16ink4a 的表達，也使細胞停滯在G1期，從而阻礙了結直腸癌LOVO細胞的細胞周期進程，并抑制細胞增殖，這與之前研究結論一致。

腫瘤侵襲和轉移是涉及各種因素和多種信號傳導途徑的復雜過程。EMT 是結腸腫瘤侵襲和轉移的一種常見過程［16］。在這個過程中，上皮細胞失去其上皮特征，并在特定的生理和病理條件下轉分化為間充質細胞。已有的研究表明EMT 促進腫瘤細胞的轉移，且在EMT 過程中觀察到E-鈣粘蛋白水平降低，而波形蛋白和纖維連接蛋白等間質標志物增加［17］。由此推測，其促進腫瘤轉移的機制可能是：E-鈣粘蛋白的減少導致細胞間粘附減少，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移［18-19］。在進一步的研究驗證中發現，BMI1 敲除增加了E-鈣粘蛋白的表達并減少了波形蛋白的表達，最后抑制EMT。結果表明BMI1 與E-鈣粘蛋白呈負相關，而與波形蛋白呈正相關，BMI1 基因敲除通過上調E-鈣粘蛋白抑制LOVO 細胞的侵襲和轉移。目前，BMI1 通過EMT 促進腫瘤遷移和轉移的機制尚不清楚。據報道，BMI1 介導Hes1 誘導的細胞增殖和遷移，下調PTEN 并激活Akt/GSK3β途徑，從而誘導EMT 和細胞骨架重建并導致癌細胞的侵襲性增強［20］。相應地，BMI1 敲除通過PTEN/p-Akt/p-NFκB/MMP-2 途徑逆轉EMT 改變，顯著抑制黑色素瘤的侵襲行為［21］。筆者推測BMI1/PTEN/Akt/信號傳導與結腸癌進展中的EMT 活化相關。此外，還有研究證明BMI1 在乳腺癌進展期間調節P16ink4a和細胞周期蛋白D1 的表達［22］。更重要的是，已證明P16ink4a 通過miR-141/miR146b-5p 及其靶標AUF1 抑制EMT 相關轉錄因子來控制衰老［23］。本研究結果發現，P16ink4a 與E-鈣粘蛋白呈正相關，與波形蛋白呈負相關。因此，筆者推測沉默BMI1可能通過上調P16ink4a 的表達來抑制EMT。

綜上，本研究發現，BMI1 基因與結腸癌的增殖，侵襲和遷移密切相關，RNA 干擾可下調BMI1表達，抑制結腸癌的侵襲和轉移，其機制可能通過上調P16ink4a 的表達而抑制EMT 相關。但BMI1有無通過其他信號通路促進結腸癌侵襲和遷移，其具體的機制仍有待進一步研究。