核轉錄因子-κB抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷對急性一氧化碳中毒大鼠模型中iNOS動態變化的影響

蔣力 雷蕊綺 彭紅艷 辜剛鳳 李經倫

西南醫科大學附屬醫院神經內科（四川瀘州646000）

過量的一氧化碳（CO）氣體被人體吸入，往往造成患者無意識的中毒，從而引起一系列嚴重的心腦肺等臨床癥狀。患者表現出以意識障礙、頭痛、惡心、呼吸困難等癥狀，尤以腦部較為嚴重［1-2］。在臨床上積極治療恢復意識后，約10% ～30%的患者容易出現短暫的假愈期，后出現以癡呆、錐體外系及精神癥狀等為主的神經系統癥狀，稱之為急性一氧化碳中毒遲發性腦病（delayed encephalophathy after acute carbon monoxidepoisoning，DEACMP）［3-5］。關于DEACMP的發生原因，目前研究認為主要與缺氧缺血、氧化應激、炎癥與免疫、細胞凋亡等有關［6］。由于血紅蛋白與CO結合生成碳氧血紅蛋白，造成組織缺氧導致炎癥免疫反應［7-8］，既往研究表明iNOS是炎癥免疫反應主要的限速酶，能誘導生成大量NO，從而介導神經細胞凋亡［9-10］。本實驗通過改良腹腔注射法建立CO大鼠中毒模型，使用二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）進行干預NF-κB的激活，觀察大鼠海馬區細胞凋亡及腦組織NF-κB、iNOS表達變化情況，從而探討NF-κB/iNOS 信號通路在DEACMP 發病中可能存在的作用，同時為DEACMP治療提供一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料250 g 左右SD 雄性大鼠（由西南醫科大學動物中心提供），99.99%高純度CO 氣體（由瀘州西南化工研究所制備）；二硫代氨基甲酸吡咯烷（sigma 公司，美國）；Morris 水迷宮（西南醫科大學中心實驗室提供）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組將120 只成年健康雄性SD 大鼠（280～300 g，SPF 級）隨機分成3 組：空氣組（AC 組）、CO 中毒組（CO 組）、PDTC + CO 中毒組（PD 組），每組40 只，每組大鼠按染毒后第1、3、7、14、21 天分為5 個小組。

1.2.2 動物模型制作采用改良式腹腔注射CO 法制備大鼠DEACMP模型［11］，其中CO組、PD組按首次劑量100 mL/kg 進行CO 腹腔注射，每間隔4 h 追加一次，追加劑量為首次劑量的一半（即50 mL/kg），共追加3 次，AC 組用等量空氣進行腹腔注射，PD組在造模前1 h 腹腔注射PDTC（100 mg/kg），造模后每天注射1 次，直至處死。

1.2.3 尾尖血COHB 含量測定和Morris 水迷宮實驗在CO 組和PD 組中各隨機抽取1 只老鼠，分別在造模后0.25、0.5、2、4、8、12、16 h 股動脈采血1 mL，全自動血氣分析儀測定HbCO 濃度。觀察大鼠染毒后發生的變化，用Morris 水迷宮檢測大鼠學習記憶能力變化情況。

1.2.4 取材將各時間點對3 組大鼠取材，每組大鼠取一半斷頭于冰面上剝離出腦組織，分離出整個海馬，置于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于Western blot 實驗。余下大鼠使用10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，行生理鹽水心臟灌洗和4%多聚甲醛固定，取腦組織制作組織切片。

1.2.5 HE 染色觀察腦組織形態常規石蠟包埋、切片，予以脫蠟，然后用乙醇脫水，行HE 染色，光鏡下觀察海馬CA1 區細胞形態學變化。

1.2.6 Western Blot檢測NF-κB、iNOS的表達將低溫保存的海馬組織分離成小塊置于勻漿器勻漿，超聲裂解組織，離心后測定蛋白濃度，SDSPAGE 凝膠電泳，經過轉膜、封閉、抗體孵育后，用Western Blot 發光檢測試劑盒顯影、定影，凝膠成像系統采集圖像，最后進行分析。

1.2.7 免疫熒光檢測NF-kB、iNOS 的表達石蠟切片經過脫蠟、梯度乙醇脫水后，放置于PBS緩沖液中漂洗，然后再置于EDTA 緩沖液中微波修復，經BSA封閉。加入一抗、二抗，DAPI染液，漂洗后用抗熒光淬滅劑封片，及時在免疫熒光顯微鏡下觀察。

1.2.8 細胞凋亡檢測常規進行脫蠟水化，采用高溫抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶活性，給予TUNEL 反應液發生酶標反應，DAB 顯色，封片后觀察，計算凋亡指數進行統計分析。

1.3 統計學方法使用SPSS 22.0 統計軟件對數據進行處理，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較使用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗。組內不同時間點比較采用重復測量方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模成功注射首劑CO時，大鼠約5 min后開始出現躁動、呼吸急促，部分大鼠皮膚黏膜呈現櫻桃紅色，首次追加大鼠出現癱軟、動作遲緩，繼續追加，出現肢體強直抽搐甚至昏迷，將其放至流動通風處，意識逐漸恢復，極少數大鼠死亡（病死率7/168），隨即補充相應數目的大鼠。及時解剖死亡大鼠，發現其血色暗紅，腹腔臟器及腦組織充血水腫。

2.2 Morris 水迷宮實驗結果水迷宮結果顯示染毒前及染毒后7 d 內3 組大鼠平均逃避潛伏期、穿越平臺次數、平臺運動總時間相比較無統計學差異（P＞0.05），染毒后第14～28 天CO 組大鼠較AC組和PD 組相比平均潛伏期顯著延長（P＜0.05），大鼠平臺所在象限運動時間、穿越平臺次數明顯減少，CO 組與AC 和PD 組比較差異具有統計學意義（P＜0.05），AC 組與PD 組相比，其差異也具有統計學意義（P＜0.05）。見圖1、2、3。

圖1 各時間點平均逃避潛伏期比較Fig.1 Comparison of average escape latency at each time points

2.3 動脈血HbCO 濃度變化各組大鼠染毒前尾血COHB 濃度均值始終低于5%，CO 組和PD 組在染毒約30 min 后取尾尖血測定碳氧血紅蛋白飽和度均值為65% 以上，行第1 次追加CO 時大鼠體內HbCO 濃度仍＞50% 以上，間隔注射CO 可使大鼠體內HbCO＞50%持續16 h 以上。

圖2 各時間點穿越平臺次數比較Fig.2 Comparison of the number through the platform at each time points

圖3 各時間點平臺所在象限運動時間比較Fig.3 Comparison of motion time in the platform at each time points

2.4 HE 染色HE 染色結果顯示CO 組大鼠海馬CA1 區神經元細胞呈核固縮性，胞內間隙增大，胞質與胞核顯示不清，細胞排列雜亂，可見壞死神經細胞被吸收后留下的龕影。AC 組大鼠海馬CA1區神經元排列整齊緊密，核膜完整，核仁清晰。PD 組大鼠海馬CA1 區神經元細胞因受到PDTC 干預的保護，其形態介于兩者之間。見圖4。

圖4 第14 天各組海馬CA1 區HE 染色（×400）Fig.4 HE staining in CA1 area of hippocampus in each group on the 14th day（×400）

2.5 Western Blot 檢測結果CO 組大鼠海馬CA1區NF-kB 于3 d 時表達明顯，隨著時間推移逐漸增加；iNOS 表達于第3 天達到高峰，后逐漸減少。AC 組NF-kB、iNOS 僅有少量表達。PD 組NF-kB 及iNOS 表達相對CO 組減少，且各時間點差異顯著（P＜0.05）。見圖5 和表1。

2.6 免疫熒光結果AC 組大鼠海馬CA1 區NF-kB、iNOS 僅有少量表達，且無動態變化，CO 組NFκB 的表達于染毒后增加（1 d），于3 d 時快速增高，后緩慢增高；iNOS 的表達于染毒后先增加，于3 d時達到峰值，后逐漸降低。PD 組各時間點NF-κB及iNOS 的表達均較CO 組降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1、2 和圖8、9。

圖5 海馬CA1 區NF-κB、iNOS 蛋白免疫印跡法結果Fig.5 results of NF-κB，iNOS protein Western imprinting in hippocampal CA1 region

圖6 NFκB p65/GAPDH 的灰度比值Fig.6 The gradation ratio between NF-κB p65 and GAPDH

圖7 iNOS/GAPDH 的灰度比值Fig.7 The gradation ratio between iNOS and GAPDH

2.7 Tunel 法檢測細胞凋亡情況AC 組大鼠海馬CA1 區各時間點僅可見極少量凋亡細胞，CO組、PD 組凋亡細胞隨染毒時間延長而明顯增多，PD 組各時間點凋亡細胞計數均明顯少于AC 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖10。

3 討論

急性CO 中毒是常見的氣體中毒，因其可導致DEACMP 而備受臨床重視，其發病機制目前尚未明了，隨著炎癥免疫反應在疾病發病機制中受到重視，NF-kB/iNOS 信號通路是否參與DEACMP 的發病及其相關調控也受到關注，一氧化氮（NO）是體內一種重要的信號傳遞分子，在炎癥免疫反應等生理及病理中發揮重要作用［12-13］。生理量的NO 可以促進遞質釋放，在大腦學習與記憶的活動中發揮作用，同時可以調節腦部的血流供應情況，保護性神經免疫防御功能，而過量的NO 表達能介導神經細胞死亡。NO 是由三種不同基因編碼的一氧化氮合酶合成的：神經元型NOS（nNOS），誘導型NOS（iNOS）及內皮型NOS（eNOS）。nNOS 和eNOS 的表達受到轉錄、轉錄后（包括RNA）及翻譯后機制（包括磷酸化、ACE）的高度調控，在生理狀態下eNOS 和nNOS 在體內均有表達。相反，在促炎和氧化應激條件下，iNOS 主要通過基因轉錄調控，其在病理損害狀態下誘導表達催化生成大量NO，隨著NO 在體內濃度的蓄集，過量的NO 會介導神經細胞死亡［14-15］。iNOS 是催化合成NO 的關鍵酶，其廣泛分布在神經元及腦血管內皮細胞中［16-17］。其受核轉錄因子（NF-κB）調控，是下游調控表達重要的炎癥反應因子，NF-κB 在體內參與了各種促炎因子、趨化因子等相關下游因子的轉錄和調控。炎癥缺氧等病理生理過程能使NFκB 激活，活化的NF-κB 與細胞核內iNOS 基因結合位點相結合，誘導iNOSmRNA 轉錄和表達，進而催化精氨基酸和氧產生大量NO，對大鼠神經細胞造成損傷。

表1 各組大鼠不同時間點NF-κB 免疫熒光吸光度比較Tab.1 Comparison of NF-κB immunofluorescence absorbance at different time points in each group ±s>

表1 各組大鼠不同時間點NF-κB 免疫熒光吸光度比較Tab.1 Comparison of NF-κB immunofluorescence absorbance at different time points in each group ±s>

注：與AC 組比較，#P＜0.05，與CO 組比較，*P＜0.05

分組AC 組CO 組PD 組例數8 8 8第1 天2 104.48±201.01 6 139.64±925.88#4 175.19±256.54#*第3 天2 026.19±109.13 8 984.53±632.63#6 940.85±592.07#*第7 天2 103.31±169.09 9 442.42±853.91#6 117.02±720.02#*第14 天2 156.21±142.40 10 589.90±921.16#5 460.19±415.81#*第21 天2 077.85±115.80 11 211.01±1 097.36#5 066.95±347.27#*

表2 各組大鼠不同時間點iNOS 免疫熒光吸光度比較Tab.2 Comparison of iNOS immunofluorescence absorbance at different time points in each group ±s>

表2 各組大鼠不同時間點iNOS 免疫熒光吸光度比較Tab.2 Comparison of iNOS immunofluorescence absorbance at different time points in each group ±s>

注：與AC 組比較，#P＜0.05，與CO 組比較，*P＜0.05

分組AC 組CO 組PD 組例數8 8 8第1 天1 521.64±236.50 4 912.37±349.54#3 179.39±569.33#*第3 天1 576.23±195.92 8 370.01±598.79#5 447.16±477.07#*第7 天1 513.63±151.08 7 219.01±342.71#4 981.73±399.28#*第14 天1 622.26±144.98 6 585.77±595.67#4 380.33±688.84#*第21 天1 513.33±142.52 6 113.04±588.87#3 613.89±612.82#*

圖8 第14 天各組海馬CA1 區NF-κB 的表達Fig.8 Expression of NF-κB in hippocampal CA1 region of each group on the 14th day

圖9 第14 天各組海馬CA1 區iNOS 的表達Fig.9 Expression of iNOS in hippocampal CA1 region of each group on the 14th day

圖10 各組大鼠不同時間點凋亡細胞數比較Fig.10 Comparison of the number of apoptotic cells in each group at different time points

本實驗通過改良腹腔注射法復制CO 中毒大鼠模型，相比自然吸入CO 其染毒程度更易控制，能夠動態監測血中COHB 濃度，大鼠動脈血COHB實驗結果也證實，間隔腹腔注射法能使大鼠體內動脈血HbCO＞50%持續16 h 以上，筆者前期動物實驗也證實此造模方法安全有效，是理想的造模方法。通過Morris 水迷宮檢測大鼠空間學習及記憶的能力，其結果顯示染毒后7 d 各組間平均潛伏期時間比較差異無統計學意義（P＞0.05），染毒后14 d 組間差異有統計學意義（P＜0.05），其時間節點上提示與臨床上遲發性腦病發病時間基本相符，再者通過證實造模成功。

既往研究表明海馬CA1 區對一氧化碳中毒等損傷最為敏感，也被稱為易損區［18-19］，所以本研究通過測定大鼠海馬CA1 區NF-κB 及iNOS 蛋白免疫印跡法結果顯示，在AC 組中僅可檢測到少量表達，CO 組染毒后第3 天海馬CA1 區NF-κB 表達明顯增多，隨著時間的推移呈現逐漸增加的過程，iNOS 的表達在染毒后第3 天達到高峰，而后逐漸減少。通過Morris 水迷宮測定大鼠學習及記憶變化結果提示，AC 組、CO 組及PD 組大鼠在染毒后前7 d 各項指標差異無統計學意義（P＞0.05），提示此時尚未發生遲發性腦病，與臨床上的假愈期時間基本一致，分析可能與染毒前期NF-κB 激活，轉錄iNOS 的表達催化合成NO，發揮了神經保護作用有關，隨著時間的推移，NO 的持續過量合成，在體內蓄積濃度的增加，發揮了持續的神經損害作用，介導神經元細胞凋亡，這也能進一步解釋CO 中毒前期未對大鼠造成嚴重的學習記憶能力損害，而隨時時間推移，損害進一步加重，從而發生了遲發性腦病的原因。

PDTC 是NF-κB 的特異性抑制劑，可以減少其表達［20-21］。本實驗使用PDTC 干預NF-κB 的表達后發現，PD 組NF-κB 的表達明顯減少，與CO 組相比組間差異明顯，具有統計學意義（P＜0.05），證實PDTC 可以抑制NF-kB 的表達，與既往文獻報道一致［22］。與此同時，iNOS在PD組的表達與CO組相比，也表現出減少的趨勢，所以筆者得出結論，NF-κB、iNOS 參與了DEACMP 的發生過程，且通過HE 染色觀察發現，使用PDTC 干預后，可以有效的減輕海馬區神經細胞的組織損害，分析其原因可能是因為NF-κB 的表達減少，使得iNOS 的轉錄調控受到限制，從而使得NO 的合成表達較少，使神經細胞的損傷減輕，進而表現在大鼠記憶及行為改變相比CO 組的改變輕。

綜上所述，筆者認為NF-κB/iNOS 信號通路參與了DEACMP 的發病過程，且扮演著重要作用，PDTC 的干預通過下調NF-κB 的激活及減少iNOS的表達，從而減輕大鼠神經細胞的損傷，morris 水迷宮行為學檢測也證實PD 組行為學改變較CO 組更輕，PDTC 的干預是否可以成為臨床上治療該疾病一種的方法還需要大量的研究來證實，也期待未來進一步的研究來證實。