廣東人群中α珠蛋白基因多拷貝頻率分布研究

魏小鳳 徐湘民 郭曉玲 周玉球 黃爍丹 劉彥慧 陳亞軍 丁紅梅商璇

1南方醫科大學基礎醫學院醫學遺傳學教研室（廣州510515），2廣東省佛山市婦幼保健院（廣東佛山528000），3廣東省珠海市婦幼保健院檢驗科（廣東珠海519000），4廣東省梅州婦幼保健院（廣東梅州514000），5廣東省東莞市婦幼保健院產前診斷中心（廣東東莞523000），6廣東省韶關市婦幼保健院（廣東韶關512000），7廣東省云浮市人民醫院婦產科（廣東云浮527300）

alpha 地中海貧血（α-thalassemia 簡稱α地貧）是一組由于α珠蛋白基因變異使得α-珠蛋白基因表達降低或缺如，致使血紅蛋白四聚體組分中的α-鏈與非α-鏈的比例失去平衡而引起溶血性貧血的遺傳性疾病［1-2］。α地貧是長江以南地區的高發出生缺陷，在南方各省的人群攜帶率分別為廣西19.11%、廣東12.7%、貴州9.26%、海南45.04%，云南6.99%［3］。與α地貧基因缺陷相比，α珠蛋白基因多拷貝相對罕見。單純的α珠蛋白基因多拷貝攜帶者臨床表型并無異常，但是合并β地貧雜合子則引起α與β珠蛋白鏈失衡從而導致個體患有中間型β地貧，合并β地貧純合子或雙重雜合子則會使患者貧血程度加重［4-8］。中間型β地貧（TI）患者有中度及以上程度貧血，常合并肝脾腫大及輕度黃疸；而重型β地貧（TM）患兒需定期輸血并應用鐵螯合劑治療，給家庭和社會帶來巨大的經濟負擔以及沉重的精神壓力［9］。如果夫婦中一方攜帶β地貧雜合，而另一方存在α珠蛋白基因的多拷貝，則他們所生的孩子有1/4 的概率是由β地貧突變雜合子合并α珠蛋白基因簇多拷貝所導致的中間型β地貧［4-8］。由此，了解人群中α珠蛋白基因的多拷貝的分布及攜帶情況也成為防控地貧的公共衛生需要之一。而此前所有的廣東人群地貧流行病學調查都極少涉及到α珠蛋白基因拷貝數增加的分布情況［3，10-16］，為此本研究目的是探討廣東人群中α珠蛋白基因多拷貝的人群攜帶頻率、變異類型及分布特征。

1 對象與方法

1.1 研究對象2015年10月至2016年3月在梅州市婦幼保健院、珠海市婦幼保健院、云浮市人民醫院、韶關市婦幼保健院、佛山市婦幼保健院、東莞市婦幼保健院以及東莞市計生所進行婚前/產前檢查的廣東籍夫婦共2 310 對。

1.2 方法

1.2.1 樣本及其數據采集EDTA抗凝管采血2 mL，同時采集夫婦對的個人信息（包括姓名、性別、年齡、籍貫、民族、聯系方式等）、地貧表型資料（血紅蛋白含量（Hb）；平均紅細胞血紅蛋白含量（MCH）；平均紅細胞體積（MCV）；Hb A2（%）和Hb F（%）以及地貧基因型常規檢查結果。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2.2 NGS 分析DNA 提取試劑盒（美基生物Magen）提取全基因組DNA，使用凝膠電泳和NanoDrop 分光光度計（Thermo Scientific，USA）測量DNA 樣品的濃度和純度。利用HiSeq2000 測序儀（Illumina，USA）進行二代測序，具體測序及分析過程參照已發表文獻［3］。

1.2.3 MLPA使用MRC-Holland 公司生產的P140-B4 HBA 試劑盒檢測α-珠蛋白基因簇中的拷貝數變異［17］，按照說明書進行操作，MLPA 探針分布見圖1A。

1.3 統計學方法計數資料采用構成比表示，計量資料用均數±標準差表示，利用SPSS 16.0 軟件對血液學參數指標進行t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 樣本組成選取夫婦雙方均為廣東籍的夫婦2 310 對，其來源情況和基本信息見表1。

表1 樣本組成Tab.1 Sample composition

2.2 表型分析對92 例α珠蛋白基因拷貝數增加的個體及92 例對應地區的正常個體的血液學指標進行統計學分析后發現，兩類人群差異均無統計學意義（表2）。

表2 正常個體與單純α珠蛋白拷貝數增加個體血液學參數對比分析Tab.2 Comparative analysis of hematological parameters between individuals and simples with multiple copies of alpha globin gene±s>

表2 正常個體與單純α珠蛋白拷貝數增加個體血液學參數對比分析Tab.2 Comparative analysis of hematological parameters between individuals and simples with multiple copies of alpha globin gene±s>

基因型αα/αα αα/ααα P 值Hb（g/L）138.86±17.76 140.26±16.87 0.621 MCV（fl）89.42±4.92 89.68±5.17 0.969 MCH（pg）29.53±1.44 29.68±2.01 0.890 HbA2（%）3.18±0.60 3.16±0.68 0.991

2.3 基因型分析

2.3.1 NGS分析4 620例樣本經NGS檢測后檢出559 例攜帶α地貧基因，同時檢出攜帶α基因多拷貝樣本92 例，合計651 例。4 620 例樣本NGS 檢測α珠蛋白基因變異結果見表3。

表3 4 620 例樣本α珠蛋白基因突變及拷貝數變異結果Tab.3 α globin gene mutation and copy number variation results of 4 620 samples

2.3.2 MLPA 分析對NGS 分析發現的92 例α珠蛋白多拷貝樣本，采用MLPA 分析進一步驗證。確定92 例 樣本中45 例攜帶αααanti3.7，47 例攜帶αααanti4.2。α珠蛋白基因拷貝數變異的MLPA 分析圖見圖1。廣東6 個代表性地區的α珠蛋白基因拷貝數增加的分布情況見表4。

表4 廣東6 個代表性地區的α珠蛋白基因拷貝數增加的分布情況Tab.4 Distribution of multiple copies of alpha globin gene in six representative regions of Guangdong

圖1 代表性MLPA 結果圖Fig.1 Representative MLPA results graph

2.3.3 高風險夫婦對由于β地貧雜合子合并α珠蛋白基因多拷貝可導致個體患有中間型地貧。根據NGS 和MLPA 的分析結果，可發現兩對傳統地貧基因檢測方法無法發現的高風險夫婦，其具體情況見表5。由表中可知，這兩對夫婦將各有1/4 的風險生出患有中間型β地貧的患兒，其基因型分別為αα/αααanti4.2，β-50/βN 和αααanti3.7/αα，βCD41-42/βN。

表5 NGS 檢測多檢出的高風險夫婦對Tab.5 new high-risk couples detected by NGS

3 討論

α珠蛋白基因的拷貝數是影響β地貧的臨床表型的重要因素之一。β地貧純合子或者雙重雜合子合并α地貧缺陷可以使患者貧血程度減輕，β地貧雜合子合并α珠蛋白基因三聯體或四聯體，則會使α/β珠蛋白比例失衡加重，使患者由無臨床癥狀或者輕型變為TI 表型［18-19］。α基因三聯體或四聯體在大多數人群中攜帶率不高，但其合并β地貧雜合子引起TI 表型的情況仍值得注意。斯里蘭卡進行的一項調查顯示，2%～3%的β地貧患者合并α基因三聯體或四聯體［20］，意大利也曾報道16 例表現為TI 表型的β雜合子中有10 例是合并了α基因三聯體的［21］。而在中國人群中β地貧雜合子合并α珠蛋白基因三聯體或四聯體使得患者表型加重的案例時有報道［5-7］。夫婦中如果一方攜帶β地貧雜合，而另一方存在α珠蛋白基因的多拷貝，則他們所生的孩子有1/4 的概率是由β地貧突變雜合子并α珠蛋白基因三聯體或四聯體所導致的TI。由此，α珠蛋白基因多拷貝的診斷成為地貧防控的一部分，人群中α珠蛋白基因的多拷貝的分布情況就成為了防控地貧的公共衛生需要之一。

過往研究顯示，單純α珠蛋白基因拷貝數增加的個體與正常個體血液學表型并無顯著差異［4-8］，本研究也發現了類似的結果。所以，通過表型篩查難以發現α珠蛋白基因多拷貝的攜帶者。既往案例中用于檢測α珠蛋白基因多拷貝的方法主要有Southern 印跡雜交技術（Southern blot）［4］、微陣列比較基因組雜交技術（array-CGH）［5，7］、MLPA［5-6，8］以及NGS［3，6，8，22］等。經典的Southern blot 檢測周期長，操作繁瑣；array-CGH 檢測周期中等，成本高，操作復雜；MLPA 價格便宜，檢測周期短，可檢測特定基因內是否存在拷貝數變異；NGS 通量高，檢測費用高，檢測周期中等，操作復雜，對全基因組水平拷貝數變異均可檢測。因此建議需要進行α珠蛋白基因拷貝數個體檢測的可以選擇MLPA 技術，而需要進行大人群檢測的可以考慮NGS 技術。

目前已報道的α珠蛋白基因多拷貝形式有ααα146kb、ααα204kb、ααα69.4kb、αααanti3.7和αααanti4.2等［3-8，20-21］，其中，中國人群中常見的是αααanti3.7和αααanti4.2。α多拷貝在廣西人群中的攜帶率為1.28%，貴州為1.79%，海南為0.92%，云南為2.25%［3］。從表4 可知α多拷貝在廣東人群中的變異類型是是中國人群中最常見的變異類型αααanti3.7和αααanti4.2，攜帶率是1.99%（92/4 620），廣東人群中α珠蛋白多拷貝的攜帶率在中國南方地貧高發地區中偏高，僅次于云南省。