杜氏鹽藻促生菌株的分離與鑒定

段露露 杭偉 程宇嬌 崔紅利 王計(jì)平 李潤(rùn)植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，太谷 030801）

杜氏鹽藻（Dunaliella salina）是綠藻門，鹽藻屬的一種極度耐鹽的單細(xì)胞真核綠藻［1］，在高鹽等極端環(huán)境中仍然能夠正常生長(zhǎng)，因此常作為耐鹽植物中的模式生物［2］。其細(xì)胞形態(tài)通常為橢圓形，具有兩條鞭毛，沒有細(xì)胞壁。鹽藻能夠積累豐富的β-胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、多糖、礦物質(zhì)等活性物質(zhì)，是天然β-胡蘿卜素的主要來源之一［3-4］。此外，還可以作為魚蝦等的飼料，在功能食品、保健等領(lǐng)域具有很好的開發(fā)利用前景。

在水生生態(tài)系統(tǒng)中，微藻和細(xì)菌之間存在密不可分的關(guān)系，它們分別扮演著重要角色，相互影響著彼此的生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)累積，共同參與水環(huán)境中物質(zhì)的循環(huán)［5］。在微藻生長(zhǎng)的過程中，藻細(xì)胞周圍會(huì)形成一個(gè)特殊的藻際微環(huán)境［6］，在這個(gè)藻際微環(huán)境中，藻細(xì)胞分泌的一些物質(zhì)會(huì)吸引周圍微生物在該環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖，形成了復(fù)雜獨(dú)特的藻際微生物群落。細(xì)菌可以利用微藻光合作用產(chǎn)生的有機(jī)物，微藻可以利用微生物呼吸作用產(chǎn)生的CO2及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［7］，形成一個(gè)循環(huán)體系，稱為“藻菌共生”［8］。在微藻的大規(guī)模培養(yǎng)過程中，這些存在于藻際環(huán)境中的細(xì)菌很難去除，且與微藻之間存在復(fù)雜的相互關(guān)系［9-10］。有些細(xì)菌對(duì)微藻有抑制作用，能夠產(chǎn)生一些殺死藻細(xì)胞的毒素或者溶藻酶等有害物質(zhì)從而抑制微藻的生長(zhǎng)。Wang 等［11］發(fā)現(xiàn)弧菌（Vibrio）能夠產(chǎn)生藻毒素殺死亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）。Lee 等［12］發(fā)現(xiàn)交替假單胞菌株（Pseudoalteromonassp.）A28 產(chǎn)生的胞外絲氨酸蛋白酶是殺死中肋骨條藻（Skeletonema costatum）的主要來源。但有些細(xì)菌對(duì)微藻的生長(zhǎng)及藻細(xì)胞中物質(zhì)的積累有明顯的促進(jìn)作用，細(xì)菌能夠產(chǎn)生吲哚乙酸及維生素B12 促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)［13］。此外，藻菌共培養(yǎng)體系能夠有效去除廢水中氮、磷及重金屬等污染物，在廢水處理方面有較好的應(yīng)用前景［14-17］。因此，探究微藻與其藻際細(xì)菌之間的相互作用并選擇適當(dāng)?shù)拇偕?xì)菌構(gòu)建共培養(yǎng)體系對(duì)微藻的生產(chǎn)及藻菌共生系統(tǒng)的應(yīng)用有重要意義。

迄今，對(duì)杜氏鹽藻的培養(yǎng)、鹽藻細(xì)胞生長(zhǎng)、β-胡蘿卜素的累積及鹽藻產(chǎn)品等已進(jìn)行諸多研究［18-20］，然而，鮮有關(guān)于鹽藻藻際細(xì)菌及其對(duì)鹽藻生長(zhǎng)影響的研究報(bào)道。為此，本研究以杜氏鹽藻及其藻液為試材，分離并鑒定鹽藻藻際共生菌群，分別構(gòu)建藻菌共培養(yǎng)體系檢測(cè)所分離的共生菌株對(duì)杜氏鹽藻藻生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物積累的影響，進(jìn)而篩選能促進(jìn)鹽藻生長(zhǎng)的優(yōu)異共生菌株，以期為促生菌株在水生態(tài)環(huán)境調(diào)控的應(yīng)用及鹽藻規(guī)模化培養(yǎng)體系優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中所用的微藻藻株為分離自運(yùn)城鹽湖水樣的杜氏鹽藻藻株Ds-SXYC-2，保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，采用DM 培養(yǎng)基培養(yǎng)鹽藻。

1.2 方法

1.2.1 共生菌株的分離純化 取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的鹽藻藻液，用無菌水稀釋。采用平板劃線法將藻液接種于LB 固體培養(yǎng)基中，置于細(xì)菌培養(yǎng)箱中30℃恒溫倒置培養(yǎng)。待長(zhǎng)出單菌落后，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征及時(shí)挑選單菌落，經(jīng)多次平板劃線直至固體培養(yǎng)基上無雜菌生長(zhǎng)，并記錄每種共生菌的形態(tài) 特征。

1.2.2 鹽藻共生菌株的鑒定 取各生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期菌液1.5 mL 離心，采用購自安徽天根生化科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取杜氏鹽藻共生菌的基因組DNA，采用16S rDNA 通用細(xì)菌引物擴(kuò)增基因組DNA。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離20 min，將條帶清晰的PCR 產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司進(jìn)行DNA 測(cè)序。測(cè)序獲得的各菌株序列分別在NCBI 中進(jìn)行比對(duì)和BLAST 分析，選取相似性較大的序列應(yīng)用MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，從而鑒定出分離菌株的種、屬分類地位。

1.2.3 微藻生物量的測(cè)定 稱量離心管的重量，記作M0。取5 mL 新鮮藻液經(jīng)超聲波破碎30 s，離心，無菌水多次沖洗去除藻液中的細(xì)菌。放入烘箱中烘干，稱量最終重量，記作M1。計(jì)算出藻樣的干重DW=（M1-M0）/V（V 為藻液體積）。

1.2.4 鹽藻色素含量的測(cè)定 培養(yǎng)15 d 后，測(cè)定鹽藻藻細(xì)胞中葉綠素與β-胡蘿卜素的含量。用甲醇萃取藻細(xì)胞中的色素，取3 mL 藻液，8 000 r/min 離心10 min，棄上清。加入等體積的甲醇在黑暗條件下萃取沉淀24 h。以甲醇為參比，采用分光光度計(jì)分別測(cè)定在波長(zhǎng)470、653 和666 nm 處藻液中的色素吸光度值，計(jì)算藻細(xì)胞中的葉綠素與β-胡蘿卜素的含量。

1.2.5 鹽藻多糖、蛋白及總脂含量的測(cè)定 采用蒽酮硫酸比色法測(cè)定鹽藻多糖含量。取5 mL 鹽藻藻液，離心10 min 后，取上清測(cè)定胞外糖含量。藻泥中加入等體積PBS 緩沖液，反復(fù)凍融3 次，經(jīng)超聲波破碎120 s，離心。各取2 mL 于試管中，加入8 mL 蒽酮硫酸溶液，沸水浴15 min 后，冷卻至室溫后采用分光光度計(jì)于625 nm 測(cè)定吸光值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出多糖含量。（葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.006 4x-0.212 9，y為吸光值；x為多糖含量，R2=0.992 7）

采用購自南京建成科技有限公司的蛋白定量測(cè)定試劑盒測(cè)定鹽藻藻細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)含量。

參考馬浩天等［21］的方法測(cè)定鹽藻總脂含量。

1.2.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)均設(shè)置3 組生物學(xué)重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 進(jìn)行整理并作圖。應(yīng)用DPS 軟件對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 鹽藻藻際共生菌落的分離

采用LB 固體培養(yǎng)基經(jīng)多次平板劃線從杜氏鹽藻藻液中共分離獲得5 株共生菌，編號(hào)為B1-B5（表1 和圖1）。3 個(gè)菌落為球形，表面光滑，邊緣整齊，顏色分別呈現(xiàn)橘黃色、橘色及白色；1 個(gè)菌落為不規(guī)則形，表面光滑，邊緣褶皺，為淡粉色；1 個(gè)菌落為乳白色球形，表面光滑，邊緣褶皺。

2.2 鹽藻藻際共生菌的鑒定

提取鹽藻藻液分離獲得的5 個(gè)菌落基因組DNA，采用通用引物擴(kuò)增獲得16S rDNA 片段大小約為1 400 bp（圖2）。將測(cè)序獲得的各自rDNA 序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast 比對(duì)分析序列相似性（表2），并進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），鑒定所測(cè)菌株的種屬分類地位。結(jié)果顯示，分離獲得的5 株共生菌分屬于3 個(gè)菌屬：菌株B1 與B2 為涅斯捷連科氏菌（Nesterenkonia），菌株B3 與B4 為鹽單胞菌（Halomonas），菌株B5 為海桿菌（Marinobacter）。

表1 杜氏鹽藻藻際細(xì)菌菌落的形態(tài)及特征

圖1 鹽藻藻際分離的細(xì)菌菌落形態(tài)

圖2 藻際菌落16S rDNA PCR 產(chǎn)物

2.3 共生菌株對(duì)鹽藻生長(zhǎng)的影響

以不接種任何菌液的杜氏鹽藻純培養(yǎng)為對(duì)照，將分離獲得的5 株共生菌分別與與杜氏鹽藻以藻菌接種比為1∶1 構(gòu)建共培養(yǎng)體系，共培養(yǎng)15 d，每隔3 d 測(cè)定一次杜氏鹽藻干重。結(jié)果如圖4 顯示，與對(duì)照組相比，5 株共生菌株對(duì)杜氏鹽藻的生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，其中菌株B3 鹽單胞菌對(duì)鹽藻的生長(zhǎng)促進(jìn)作用顯著。培養(yǎng)15 d 后，鹽藻生物量達(dá)到2.3 g/L，比對(duì)照組增加了28.9%；其次為菌株B1 涅斯捷連科氏菌，鹽藻生物量達(dá)到2.19 g/L，相比對(duì)照組增加 了22.8%。

表2 五個(gè)鹽藻藻際細(xì)菌16S rDNA 測(cè)序結(jié)果

圖3 從鹽藻藻際分離到的5 個(gè)菌群及其他已知菌群16S rDNA 序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖4 五株共生細(xì)菌對(duì)鹽藻藻細(xì)胞生物量的影響

2.4 共生菌對(duì)鹽藻色素含量的影響

測(cè)定了培養(yǎng)15 d 之后共培養(yǎng)體系中鹽藻藻細(xì)胞的色素含量。圖5 表明，與對(duì)照相比，菌株B1 與B2 能夠使鹽藻藻細(xì)胞中富集更多葉綠素a 和β-胡蘿卜素，但葉綠素b 含量明顯下降。菌株B4 與B5顯著抑制了鹽藻藻細(xì)胞葉綠素的累積，但對(duì)β-胡蘿卜素的積累無明顯作用。菌株B3 使鹽藻藻細(xì)胞中葉綠素b 含量稍有提高，但與對(duì)照相比差異不顯著，而葉綠素a、β-胡蘿卜素的含量則顯著增加。培養(yǎng)15 d 后葉綠素a 的含量達(dá)到4.61 mg/L，相比對(duì)照組增加了36.3%，β-胡蘿卜素比對(duì)照組提高了56.4%，達(dá)到3.34 mg/L。

圖5 五株共生細(xì)菌對(duì)鹽藻藻細(xì)胞色素含量的影響

2.5 共生菌對(duì)鹽藻多糖含量的影響

測(cè)定了共培養(yǎng)體系中鹽藻多糖（胞外多糖與胞內(nèi)多糖）的含量。結(jié)果（圖6）顯示，菌株B1 與B2 使鹽藻中胞外多糖含量有所下降，但總糖含量比對(duì)照組略高。鹽藻與菌株B4 共培養(yǎng)能夠產(chǎn)生更多的胞內(nèi)多糖，胞外多糖無顯著提高。菌株B3 與B5 能顯著促進(jìn)鹽藻胞外及胞內(nèi)多糖的分泌。培養(yǎng)15 d 后，鹽藻多糖分別達(dá)到97.3 mg/L 和90.38 mg/L，比對(duì)照組分別提高了34.8%和25.2%。

圖6 五株共生細(xì)菌對(duì)鹽藻多糖含量的影響

2.6 共生菌對(duì)鹽藻可溶性蛋白含量的影響

測(cè)定鹽藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量（圖7）表明，菌株B5 對(duì)鹽藻蛋白質(zhì)的產(chǎn)生無顯著作用，其余4 株共生菌都能夠顯著促進(jìn)杜氏鹽藻蛋白質(zhì)的積累，其中菌株B3（鹽單胞菌）的促進(jìn)效果最佳，培養(yǎng)15 d后，蛋白質(zhì)含量達(dá)到21.89 mg/L，比對(duì)照組增加了71.2%；其次為菌株B2，蛋白質(zhì)含量為20.42 mg/L。

2.7 共生菌對(duì)鹽藻總脂含量的影響

圖8 結(jié)果表明，有4 株共生菌對(duì)鹽藻油脂積累的促進(jìn)作用顯著，其中菌株B3 能夠使鹽藻積累更多的油脂。共培養(yǎng)15 d 之后，與不添加任何菌株培養(yǎng)的對(duì)照組相比，與菌株B3 共培養(yǎng)的體系中，鹽藻總脂含量提高了37.6%，達(dá)到21.9%。

圖7 五株共生細(xì)菌對(duì)鹽藻蛋白質(zhì)含量的影響

圖8 五株共生細(xì)菌對(duì)鹽藻總脂含量的影響

3 討論

在水生環(huán)境中，微藻是重要的初級(jí)生產(chǎn)者，而微藻在生長(zhǎng)過程中常常伴隨著藻際微生物的存在［22］。不同的微藻其藻際微生物各不相同，同一種微藻在不同的環(huán)境中其藻際微生物也存在差異。目前，許多研究者嘗試探究微藻與其藻際微生物的相互關(guān)系及作用機(jī)制。本研究分離并鑒定了杜氏鹽藻藻際細(xì)菌菌群，從杜氏鹽藻中共分離獲得5 株共生菌株，經(jīng)鑒定分屬于3 個(gè)菌屬：菌株B1 和B2 為涅斯捷連科氏菌、菌株B3 與B4 為鹽單胞菌和菌株B5為海桿菌。Wang 等［23］從鹽藻中分離獲得一株麥?zhǔn)辖惶鎲伟ˋlteromonas macleodii）。Song 等［24］分析發(fā)現(xiàn)杜氏鹽藻中的優(yōu)勢(shì)菌株為Winogradskyella algicolasp.。本研究未從杜氏鹽藻中分離獲得這兩株共生菌株，這可能與鹽藻及菌株的生長(zhǎng)環(huán)境及培養(yǎng)條件不同有關(guān)。

細(xì)菌對(duì)微藻的影響存在很大差異。曹延群等［25］發(fā)現(xiàn)赤細(xì)菌（Erythrobacter citreus）能顯著促進(jìn)三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）的生長(zhǎng)。許平平等［26］從鹽生小球藻（Chlorella salina）中分離獲得一株鹽單胞菌Halomonassp.，發(fā)現(xiàn)鹽單胞菌能有效促進(jìn)鹽生小球藻對(duì)砷的富集。季方等［27］從黃化的螺旋藻中分離得到一株鹽單胞菌，該菌能抑制螺旋藻的生長(zhǎng)，對(duì)螺旋藻有較好的溶解作用。胡修貴等［28］從對(duì)蝦養(yǎng)殖池的生物絮團(tuán)中篩選獲得2 株鹽單胞菌，發(fā)現(xiàn)勝利鹽單胞菌Halomonas shengliensis對(duì)氨氮有較高的轉(zhuǎn)化率。本研究發(fā)現(xiàn)5 株共生菌均能促進(jìn)杜氏鹽藻的生長(zhǎng)，其中菌株B3 鹽單胞菌對(duì)鹽藻生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最顯著。共培養(yǎng)15 d 后，杜氏鹽藻生物量達(dá)到2.3 g/L，比對(duì)照組增加了28.9%。其次為菌株B1 涅斯捷連科氏菌。而鹽單胞菌菌株B4對(duì)鹽藻生長(zhǎng)促進(jìn)作用不明顯，且抑制藻液中葉綠素的積累。

本研究發(fā)現(xiàn)篩選獲得的菌株B3 鹽單胞菌不僅可以促進(jìn)鹽藻藻細(xì)胞生長(zhǎng)，還可以顯著促進(jìn)鹽藻代謝產(chǎn)物的積累。共培養(yǎng)體系中，杜氏鹽藻葉綠素a的含量達(dá)到4.61 mg/L，相比對(duì)照組增加了36.3%，β-胡蘿卜素比對(duì)照組提高了56.4%。Ji 等［29］構(gòu)建了小球藻（Chlorella vulgaris）與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）共培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌能促進(jìn)藻細(xì)胞生長(zhǎng)及葉綠素a 積累。王書亞等［30］研究發(fā)現(xiàn)微小桿菌、枯草芽孢桿菌和假單胞菌明顯促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)，葉綠素a 的含量比小球藻純培養(yǎng)時(shí)分別提高了1.79 倍、1.58 倍和1.49 倍。與鹽藻純培養(yǎng)對(duì)照相比，與菌株B3 共培養(yǎng)，鹽藻多糖、蛋白質(zhì)、總脂含量達(dá)到最高，分別比對(duì)照組增加了34.8%、71.2%和37.6%。一些研究也表明細(xì)菌對(duì)微藻代謝產(chǎn)物積累有促進(jìn)作用。Toyama 等［31］發(fā)現(xiàn)與Emticiciasp. EG3 共培養(yǎng)能夠提高纖細(xì)裸藻（Euglena gracilis）的生物量及油脂含量。衛(wèi)治金等［32］構(gòu)建了小球藻與固氮菌共培養(yǎng)體系，研究發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系中小球藻的生物量及油脂含量顯著提高。施華升［33］研究表明污泥細(xì)菌與小球衣藻形成的菌藻聚集體胞外分泌多糖比微藻純培養(yǎng)增加60.41 mg/L。Ban 等［34］發(fā)現(xiàn)假單胞菌能夠使萊茵衣藻的蛋白質(zhì)含量保持在較高水平。史玉倩等［35］發(fā)現(xiàn)水稻內(nèi)生泛菌能夠顯著提高小球藻生長(zhǎng)及油脂含量且藻細(xì)胞可溶性蛋白產(chǎn)量比對(duì)照顯著增加了30.91%。鹽單胞菌對(duì)鹽藻生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物積累的促進(jìn)作用，可能是在共培養(yǎng)過程中，鹽單胞菌產(chǎn)生或分泌更多調(diào)控微藻代謝產(chǎn)物積累相關(guān)基因的物質(zhì)，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)為研究鹽藻與其藻際菌群互作機(jī)制和在杜氏鹽藻規(guī)模化培養(yǎng)中應(yīng)用優(yōu)勢(shì)促生菌提高鹽藻生產(chǎn)效益提供了科學(xué)參考。

4 結(jié)論

從杜氏鹽藻藻際分離獲得5 個(gè)細(xì)菌菌群/株（B1-B5），構(gòu)建藻菌1∶1 共培體系測(cè)試表明這5 個(gè)細(xì)菌能不同程度促進(jìn)鹽藻生長(zhǎng)，其中鹽單胞菌菌株B3 為顯著促進(jìn)鹽藻生長(zhǎng)及β-胡蘿卜素等代謝產(chǎn)物積累的優(yōu)勢(shì)菌株。