鮮切香菇貯藏過程中質構變化與自溶自噬分析

趙爽 蘇哲 谷彤彤 高琪 榮成博 宋爽 劉宇

（北京市農林科學院植物保護環境保護研究所，北京 100097）

香菇（Lentinula edodes），又名花菇、香蕈、香菌、冬菇，是我國特產及出口量較大的食用菌之一［1］，也是市場上重要的食用菌消費品種。香菇富含蛋白質、氨基酸、多種維生素和具有免疫調節作用的香菇多糖，可以提高人體免疫力，具有防癌抗癌、降血壓血脂、抗氧化抗炎癥等藥理作用［2-5］。新鮮香菇組織含水量高，新陳代謝旺盛，容易出現老化、褐變等品質下降的現象，目前在保鮮加工領域中，研究多集中于整體鮮菇保鮮技術的開發，如低溫貯藏、涂膜處理、輻照除菌等，葉靜君報導低溫氣調可以減少香菇的失重率、降低多酚氧化酶的活性，減少褐變［6］；李艷杰等［7］報道利用1 μL/L 1-MCP處理香菇可以保持其感官品質，防止褐變、提高氧化能力，但對于鮮切香菇加工的研究未見報道。

食用菌鮮切是果蔬鮮切加工領域中的一個分支，相關的研究較為缺乏，食用菌子實體含水量高，呼吸蒸騰作用強，經過鮮切加工后，組織會受到機械損傷，引起一系列生理生化反應，同鮮切果蔬產品類似，發生組織軟化、氧化褐變、風味下降、腐敗劣變等問題［8-12］，同時真菌細胞在受到損傷后激發自溶自噬的程序，鮮切食用菌在環境和老化自溶機制的共同作用下，組織結構如何變化，細胞如何消融，這一過程仍然沒有被闡明揭示。

本研究以香菇作為原材料，根據鮮切最小加工原則，對其進行處理包裝和貯藏，通過質構分析結合鮮切香菇的衰老變化，研究香菇在鮮切加工后品質劣變、老化自溶時組織微觀現象以及細胞內超微結構的改變，闡述鮮切香菇貯藏期的自噬過程，旨為鮮切香菇加工技術的保鮮與應用提供理論分析。

1 材料與方法

1.1 材料

香菇選用市場上常見的“0912”品種，由北京三寶香農業科技發展有限公司提供，采摘當天挑選無機械損傷、菇形大小、菌蓋厚度、重量均一的香菇，清洗、瀝干后切根。將香菇切成3 mm 左右薄片，裝入食品密封包裝袋后封口（每袋10±0.2 g），分別置于低溫（4℃）、常溫（25℃）條件下保存，每個處理設置3 個重復，每隔2 d 取樣一次至樣品完全腐爛，將每一時間點的樣品進行處理，開展品質以及抗氧化能力檢測。

1.2 方法

1.2.1 品質指標測定

1.2.1.1 硬度 參照Ye 等［13］的研究方法，略有改動。使用探針直徑為3 mm 的硬度計（FR-5120）測定香菇片菌蓋中心部位的硬度，每個處理進行6 次測定，取其平均值。

1.2.1.2 失重 采用稱重法［14］，記錄同一樣品在整個儲藏過程中質量變化。

失重率 =（貯藏前的重量-貯藏后的重量）/貯藏前的重量 ×100%

1.2.1.3 褐變 參考王清章等［15］的方法，略有改動。將1 g 樣品加入9 mL 的蒸餾水，破碎勻漿，離心，取上清稀釋液10 倍后，測定410 nm 處的測定吸光度（A），以此用來判斷褐變程度。

1.2.2 抗氧化能力測定 準確稱取5 g 組織樣品，按重量（g）∶體積（mL）=1 ∶9 的比例加入9 倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下，制成10%組織勻漿液，4 000 r/min 離心10 min，取上清備用，作為待檢測樣品。

1.2.2.1 總抗氧化能力（AOC）測定 取低溫貯藏條件下0、2、4、6、8、10、12、14 d 及常溫貯藏條件下0、2、4、6、8 d 的樣品，利用總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（南京建成生物工程研究所）進行檢測。

1.2.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）測定 取低溫貯藏條件下0、2、4、6、8、10、12、14 d 及常溫貯藏條件下0、2、4、6、8 d 的樣品，利用超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所）進行檢測。

1.2.2.3 過氧化氫酶（CAT）測定 取低溫貯藏條件下0、2、4、6、8、10、12、14 d 及常溫貯藏條件下 0、2、4、6、8 d 的樣品，利用過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成生物工程研究所）進行檢測。

1.2.3 老化自溶結構變化

1.2.3.1 菌絲結構分析 對鮮切香菇和老化樣品進行取樣，選取香菇片中間、非菌褶部位，用消毒刀片切取小塊組織（0.2 cm×0.2 cm×0.1 cm），加入到2.5%的戊二醛磷酸緩沖液（GA）中固定12 h，固定后的樣品用消毒刀片切成單層組織，置于載玻片上，覆上蓋玻片后輕輕捻壓分散組織，光鏡下觀察組織形態，通過計數法統計菌絲數量和菌絲中鎖狀聯合數量。

1.2.3.2 細胞膜結構分析 對鮮切香菇和老化樣品進行取樣，子實體組織用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffered saline PBS）洗滌3 次，去除GA 固定液，用10 μmol/L 細胞膜紅色熒光探針（1，1′-dioctadecyl-3，3，3′，3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate DiI）標記液浸沒組織切片，避光浸染20 min，用0.1 mol/L PBS 沖洗切片3 次，將切片置于載玻片上，覆上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察細胞膜的著色情況。

1.2.3.3 細胞核檢測分析 對鮮切香菇和不同處理的樣品進行取樣，切片，組織用0.1 mol/L PBS 洗滌3 次，用乙醇-乙酸固定液處理組織30 min，在樣品上滴加50 μL 8 mg/L 的DAPI 孵育1 h，滴加抗熒光淬滅封片液50 μL，覆上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3.4 細胞內部DNA 碎片分析 對鮮切香菇和不同處理的樣品進行取樣，切片，利用2.5%的戊二醛磷酸緩沖液（GA）固定12 h，去除GA 固定液，用0.3% 的Triton X-100 溶液孵育5 min，再用PBS 洗滌2 次，在樣品上滴加新鮮配置的TUNEL（TdT 酶5 μL，熒光標記液45 μL），37℃避光孵育1 h，用PBS 洗滌3次，滴加抗熒光淬滅封片液50 μL，覆上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3.5 細胞超微結構分析 對鮮切香菇和不同處理的樣品進行取樣，利用2.5%的戊二醛磷酸緩沖液（GA）固定12 h，采用乙醇脫水處理后，包埋于電鏡專用樹脂中，將包埋樣品送往清華大學公共檢測平臺利用透射電鏡（TEM）分析細胞內的結構變化。

1.2.4 數據分析 所得數據均由平均值和標準偏差表示，每個處理重復3 次。利用Excel 2016 軟件進行方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示顯著性差異。

2 結果

2.1 鮮切香菇外觀分析

鮮切香菇片隨著貯藏期的延長，其表觀形態明顯發生劣變。從產品表觀分析新鮮香菇經過鮮切加工后貯藏初期會出現菇體褐變、失水干縮、菇體變軟的現象，說明菇體已經開始發生明顯的生理改變以及加速老化進程；隨著貯藏期的延長，菇體表面出現黏膩、出水，氣味物質發生改變的現象，說明此時菇體已經開始在多種作用下發生老化消融的現象。通過觀察發現貯藏在25℃條件下，香菇切片在第8 天嚴重褐變腐爛劣變，設為實驗終點；貯藏在4℃條件下，第16 天設為實驗終點。

2.2 不同溫度條件下鮮切香菇品質的變化

硬度與香菇片腐敗程度存在直接關系，是品質的屬性之一。鮮切香菇片的硬度隨貯藏期的延長而下降（圖1），各處理組在前2 d 均表現出硬度顯著下降（P＜0.01），其后4℃的貯藏條件相對于25℃的貯藏條件菇片軟化進程減緩，在第6 天的時候，4℃處理組硬度顯著高于25℃處理組（P＜0.05）。

圖1 不同溫度對鮮切香菇硬度的影響

香菇經過鮮切加工后增加了表面積，水分蒸發量增大，失水達到一定程度時，對其品質和生理代謝都會產生很大的影響。在4℃和25℃的貯藏條件下，鮮切香菇的失重率隨著貯藏期的延長而增加（圖2）。由于溫度可以影響菇體內水分的蒸發，因此25℃的貯藏條件下的失重率顯著高于4℃的貯藏條件下的失重率，在第4 天時25℃處理組的失重率為8.3%，而4℃處理組的失重率僅為3%，在25℃貯藏條件的實驗終點第8 天，失重率達到了21%，4℃貯藏條件的實驗終點第16 天，失重率為14.7%。因此4℃的貯藏條件更有利減少鮮切香菇的水分流失，保持良好的外觀。

圖2 不同溫度對鮮切香菇失重率的影響

褐變是評價鮮切香菇品質的指標之一。圖3 顯示，25℃貯藏組在第4 天之后褐變出現激增，褐變程度顯著高于4℃貯藏組（P＜0.05）。相比較而言， 4℃貯藏組褐變程度平穩變化，說明4℃的貯藏條件可以保持香菇片的顏色，減少褐變的發生。

圖3 不同溫度對鮮切香菇褐變的影響

2.3 不同溫度對鮮切香菇品質抗氧化活性的影響

由圖4 可以發現，隨著貯藏期的延長，各種溫度條件下，香菇切片的抗氧化能力都是呈現下降的趨勢，其中在25℃的貯藏條件下，抗氧化能力的損失更為顯著。AOC 活性檢測結果顯示在第2、4 天時，25℃處理組的總抗氧化活性已經顯著低于4℃處理組（P＜0.05）。在第2、4 天時，CAT 活性在不同處理組間差異最大（P＜0.05），4℃處理組的CAT活性分別是25℃處理組的1.4 倍和2.6 倍。SOD 活性檢測結果同樣顯示出25℃處理組的酶活性下降為迅速，在第8 天時，其活性僅為4℃處理組SOD 活性的28.5%。

從生理生化指標分析結果中可以發現，低溫貯藏條件有利于鮮切香菇的品質保持，低溫環境可以減少蒸騰作用，減少微生物的繁殖，減緩組織氧化的進程，從而降低了菇體的軟化、褐變和腐敗，是延長鮮切香菇貨架期的重要儲存條件。

2.4 組織微觀結構變化及自噬現象

香菇在采收后仍然處于生命旺盛期，切片鏡下可觀測到細胞間的鎖狀聯合結構，通過計算相同菌絲數中鎖狀聯合的比例發現，鎖狀聯合結構在所有細胞中占比約為25%（圖5-A）。而在老化切片中，菌絲邊緣壁膜結構模糊不清，推測開始發生自溶自噬現象，未見到菌絲細胞間存在鎖狀聯合的結構，說明此時切片組織已經老化（圖5-B）。

圖4 不同溫度對鮮切香菇抗氧化活性的影響

圖5 菌絲體鎖狀聯合結構消失（400×）

利用DiI 探針對貯藏末期的香菇片進行染色，對比光鏡下的細胞結構，可以發現細胞內的膜結構出現斷裂，細胞膜發生消融，已經呈現出不完整的狀態（圖6），推測細胞膜的缺失與香菇片的軟化具有一定的關聯。

圖6 DiI 標記細胞膜的缺失現象（400×）

細胞在發生凋亡時，會激活一些DNA 內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA?；蚪MDNA 斷裂時，暴露的3′-OH 可以在末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）的催化下加上綠色熒光探針熒光素進行標記，TUNEL 染色法也是基于此，從而標記了細胞內斷裂的DNA 片段，通過激發后，可在515-565 nm 處檢測到綠色熒光，利用熒光顯微鏡可以觀察到細胞內DNA 斷裂的情況。DAPI 是一種能夠與雙鏈DNA 結合的藍色熒光染料，它標記的是細胞核內完整的DNA，此染料需要在紫外光下激活，在460 nm處檢測藍色熒光，用以表示細胞核的狀態。

如圖7 所示，對比光鏡菌絲形態，經過TUNEL染色后，菌絲內出現很多綠色的熒光亮點，說明此時菌絲體中存在大量的DNA 碎片，而DAPI 染色后，未在菌絲體中發現明顯的核狀著色體，說明此時的細胞中不存在細胞核。結果暗示細胞內伴隨著DNA的斷裂，細胞核已經消融，細胞進入到自溶自噬進程。

圖7 熒光標記細胞核和DNA 的斷裂現象（400×）

通過透射電鏡的檢測，可以直觀的觀察到細胞宏觀以及內部的結構形態變化，從圖8-A 中可以觀察到新鮮香菇切片細胞外層具有厚實的細胞壁，細胞內部細胞器清晰，胞質均勻。對比圖8-B 顯示的老化細胞，可明顯發現衰老細胞內胞質消融，胞內液泡增大，胞壁變薄，細胞形態發生明顯變化。

圖8 透射電鏡下新鮮香菇和老化香菇細胞比較

進一步從微觀角度分析細胞內的結構變化，圖9 顯示的是細胞內的超微結構。新鮮香菇切片細胞中可觀測到細胞壁厚實，胞質均勻，內部細胞器結構清晰，液泡大小正常。而老化細胞形態差異較大，可見胞壁消融、缺失的現象，細胞發生破損，同時胞內可見褐色沉淀，細胞顏色加深（圖9-B），部分細胞中出現吞噬泡，發生自體自噬現象（圖9-C），最終胞內只存有大量的空泡體，細胞器消失，胞壁裂解的現象（圖9-D）。

圖9 透射電鏡下超微觀結構觀察

3 討論

鮮切加工技術的發展為市場提供了新鮮、營養、方便的食品，目前鮮切對象分為鮮切蔬菜、鮮切水果及鮮切中藥材3 大類，涉及的品種主要有生菜、馬鈴薯、西蘭花、黃瓜、菠蘿、蘋果、三七、延胡索等［16-20］。對于鮮切食用菌的研究報道為數不多，陳學玲［21］研究了次氯酸鈉、二氧化氯、過氧化氫、乙醇4 種殺菌劑對鮮切香菇品質的影響發現，150 mg/L NaClO 抑菌效果最佳；趙春霞［22-23］研究發現90%高體積分數氬氣能維持香菇的可溶性固形物含量，保持硬度和白度，同時0.5%殼聚糖+1.5%海藻酸鈉涂膜處理能夠提高氬氣的效果。目前鮮切果蔬加工技術的研究側重于清洗除菌、物理保鮮、化學涂膜保護、氣調包裝等方面的研究。針對食用菌組織脆嫩、含水量高、代謝旺盛易老化的特點，相關的基礎和技術研究未見報道。

本研究通過加工破壞了香菇子實體的整體結構，增加了菌肉和菌絲與外界環境的接觸。外界的不利因素，如微生物的浸染、氧氣的氧化等，伴隨著菌體的應激自噬機制，加速了一系列的生理生化反應，使裸露組織加速劣變。品質及抗氧化能力檢測發現低溫貯藏環境可以保持鮮切香菇的品質，減緩褐變的速度，降低菇體抗氧化能力的損失，延長貨架期，這一研究結果與寇莉萍等的研究一致［6］。研究發現在儲藏前期菇體會發生明顯的軟化，這與組織的應激損傷機制有一定的關系，激活了體內的自噬水解酶，組織啟動了進入自噬凋亡程序，利用顯微技術也印證了自噬的特征現象，觀察發現組織細胞內的正常生理結構發生劣變，出現胞壁斷裂、胞膜消融、自噬體吞噬細胞器、大量DNA 斷裂、細胞核消失以及細胞解體等現象，進一步結合細胞凋亡的相關分析可以對鮮切香菇自溶自噬的現象進行機理層面的揭示。

4 結論

本研究結果顯示香菇切片在貯藏期出現的最主要問題是切片軟化、褐變和抗氧化活性降低，從而降低了貨架期的產品品質。微觀結構研究顯示鮮切香菇經過機械損傷后激發了自溶自噬機制，細胞內出現胞壁斷裂、胞膜消融、自噬體吞噬細胞器、大量DNA 斷裂、細胞核消失以及細胞解體等現象，是引發香菇片軟化重要原因之一。本研究結果展示了鮮切香菇在不同貯藏溫度下的生理生化的改變，揭示了產業化生產需要面臨的技術問題，鮮切香菇工廠化生產需要在減少微生物污染、抗氧化、失水等問題上加大攻關，從而提高鮮切產品的品質，延長產品的貨架期。