神經內分泌標志物 ProGRP、 CGA、NSE在肺小細胞癌患者中表達的臨床意義及對預后的影響

趙玉捧 籍順利 盧亮 鄭爽 李小亮 耿玉霞

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，根據其細胞形態學、生物學和臨床特征的不同，可分為小細胞肺癌((small cell lung cance， SCLC)(15%～20%)和非小細胞肺癌((non small cell lung cance， NSCLC)(80%)。

SCLC的特點是其快速倍增時間和早期的轉移傾向[1-3]。最新的研究證實，SCLC的主要預后指標為患者的表現狀態和疾病分期[4- 6]。SCLC的典型特征是其神經內分泌現象，可以通過對胞質內的神經內分泌顆粒及一些神經肽類、激素類的分泌物的監測，從而得到SCLC形態學和功能學上的重要信息。但這些血清神經內分泌標記在臨床實踐中尚未被常規用作預后指標。神經元特異性烯醇化酶 (neuron-specific enolase, NSE)也稱作烯醇化酶-γ，是一種神經/神經內分泌特異性烯醇化酶的同工酶。NSE參與糖的有氧酵解，可以在神經起源或神經內分泌起源的腫瘤中檢測到NSE，也可以在紅細胞、血漿細胞和血小板中找到，在SCLC中水平較高[7]。嗜鉻粒蛋白A(chromogranin A, CGA)是一種49 kDa的酸性可溶蛋白，普遍存在于神經內分泌組織中，并且在SCLC患者表現為升高水平。促胃泌素釋放肽(pro-gastrin-releasing peptide,ProGRP)是一種胃腸激素，存在于胎兒肺中的神經纖維、腦和神經內分泌細胞，在SCLC患者中普遍升高，但是由于其在血清中非常不穩定而未被用作診斷標志物。各種研究表明，其前體蛋白ProGRP在區分SCLC和NSCLC的能力方面優于其它標記物[8- 9]。本文前瞻性分析SCLC患者的神經內分泌標記CGA，ProGRP和NSE表達水平，探討其可能在SCLC患者中的臨床意義以及對預后的影響。

資料與方法

一、研究對象

收集本醫院病理科確診的并未接受治療的SCLC患者40例(23名男性/17名女性)，中位年齡為62歲(37～78歲)，22例患者疾病分期為局限期，18例患者為廣泛期。25例患者的一般健康狀態評分(PS)為0～1分，15例患者的一般健康狀態評分(PS)為 2～4分。 中位隨訪時間為13個月(范圍1～31個月)。采用2009年國際肺癌組織的TNM分期標準對SCLC進行分期。所有患者均簽訂知情同意書，本研究同時經醫院倫理道德委員會審核通過。

納入標準：(1)病理證實為小細胞肺癌SCLC；(2)年齡18～70歲；(3)PS評分≥4；(4)有可測量病灶(CT測得長徑≥10 mm)；(5)心電圖、血常規、肝腎功能、骨髓功能基本正常；(6)未進行其他抗腫瘤治療；(7)預計生存期大于3個月；(8)患者及家屬同意接受本方案治療，依從性好。

排除標準：(1)造血功能嚴重障礙者；肝腎功能嚴重損害患者；(2)精神病患者；(3)懷孕或哺乳期婦女；(4)療效觀測部位合并放療；(5)復治患者。

二、 主要觀察指標及其定義

所有患者在化療開始前1 d清晨采集其靜脈血清(采集量多少)，并儲存在- 80℃。所有患者均接受順鉑-依托泊苷化療，順鉑30 mg/m2靜脈滴注，第1～3天；依托泊苷100 mg/m2靜脈滴注，第1～5天，每21～28 d重復，最多六個周期。血紅蛋白(Hb)、血清肌酐、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、白細胞、白蛋白等測定，均在化療開始前進行檢測。血清CGA采用“雙位點夾心”免疫放射分析(CGA-RIACT)進行測量，單克隆抗體抗人CGA的氨基酸序列分別為145～197和198～245，該檢測檢測到完整的分子和不同的分子片段。血清NSE使用市售的固相“雙位點夾心”免疫放射分析(ELSA-NSE)進行測量，擬分析探討兩種單克隆抗體，第一個是特定的NSE涂覆在埃爾莎固相上，第二個是放射性標記的碘-125，并被用作示蹤劑。血清ProGRP采用ELISA試劑盒(廠家)測定。所有患者以病例跟蹤、電話隨訪為主，短信隨訪為輔。臨床分期以病理和病歷資料對照2009年國際肺癌組織的分期標準并結合影像學或病理學、細胞學檢查對SCLC進行分期，分為局限期和廣泛期；從病理確診之日開始至死亡，以月為單位計算患者總生存期。

三、統計學方法

用 SPSS20.0 軟件進行數據整理、篩選與統計分析：計數資料數據以N(%)形式記錄，兩組間計量指標采用獨立樣本t檢驗進行組間比較；采用Kaplan-meier法繪制生存曲線，計算平均生存期并驗證等比例風險假設，采用log-rank檢驗比較一般資料及臨床資料生存率的差別，并行多因素COX回歸進行單變量及多變量生存分析，并根據單變量分析中有意義的變量納入多變量Cox回歸分析，以探究患者生存預后的獨立影響因素。按0.05檢驗水準，P<0.05則差異具有統計學意義。

結 果

一、SCLC癌患者血清中CGA，ProGRP，NSE水平

SCLC患者血清中NSE，CGA，ProGRP水平與年齡及性別無關，但隨著健康狀況及疾病等級的變化而顯著變化。一般健康狀態評分為2～4分的患者，相比于一般健康狀態評分為0～1的患者，血清中CGA水平(99.26vs59.34 ng/mL；P<0.001), ProGRP水平(207.10vs112.69 pg/mL；P<0.001)，NSE水平(48.43vs32.64 ng/mL；P<0.001)顯著升高。同時疾病分期在廣泛期的患者相比于分期為局限期的患者，血清中也具有更高的神經內分泌相關標志物，(CGA 82.34vs55.64 ng/mL，P<0.001；ProGRP 183.69vs88.91 pg/mL；P<0.001，NSE 47.19vs26.20 ng/mL；P<0.001)(見表1)。

表1 SCLC癌患者血清中CGA，ProGRP，NSE水平

二、單因素和多因素生存分析

納入研究的SCLC患者中位生存期為13個月。單因素變量分析發現存活率與一般健康狀態評分(P=0.001)，疾病分期(P<0.001)以及血清中CGA(P<0.001)，ProGRP(P<0.001)和NSE(P<0.001)的水平狀態具有顯著相關性，并具有統計學意義。而與年齡及性別不具有統計學意義(見表2)。

單變量Cox回歸模型發現一般健康狀態評分(B=-0.774；P=0.002)、肺小細胞癌分期(B=-1.073；P<0.001)、血清中CGA(B=0.116；P=0.001)、ProGRP(B=0.037；P=0.017)、NSE(B=0.221；P=0.007)是統計學上生存率的重要預測因子(見表3)。

單變量分析發現，健康狀態PS≥2的患者(中位生存期為12vs14個月，P=0.001)(圖1)，肺小細胞癌分期為廣泛期的患者(中位生存期為10vs15個月，P<0.001)(圖2)，血清CGA水平 >56ng/mL(中位生存期為10vs14個月，P<0.001)(圖3)，血清ProGRP水平 >58 pg/mL(中位生存期為10vs15個月，P<0.001)(圖4)，血清NSE水平 >19 ng/mL(中位生存期為10vs15個月，P<0.001)(圖5)，具有更短的生存期。

表2 預后因素的Kaplan-Meier生存分析

表3 Cox 單變量回歸分析

圖1 SCLC患者一般健康狀態評分的生存曲線

圖2 SCLC患者疾病等級的生存曲線

圖3 SCLC患者血清中CGA水平的生存曲線

圖4 SCLC患者血清中ProGRP水平的生存曲線

使用多重Cox回歸模型分析所有顯著變量(表4)，發現健康狀態PS和肺小細胞癌分期是生存率的顯著預測因子(分別為B=-0.799；P=0.001和B=-1.171；P<0.001)。

圖5 SCLC患者血清中NSE水平的生存曲線

變化因素BHR95%CI for HRWald值P值健康狀態(2～4)-0.7990.4500.280～0.98711.2530.001 分期(廣泛期)-1.1710.3100.177～0.68713.456<0.001CGA(>56 ng/mL)-0.0200.9800.975～1.1291.3460.246 ProGRP(>58 pg/mL)0.0021.0020.972～1.0942.5890.108 NSE(>19 ng/mL)0.1351.1450.97～1.5680.0710.790

討 論

SCLC是一種具有神經內分泌(neuro endocrine，NE)分化特征的惡性腫瘤。因此，神經內分泌標志物如神經元特異性烯醇化酶(NSE)，嗜鉻粒蛋白A(CGA)，突觸素(Synaptophysin, Syn)，肌酸激酶BB(Creatine kinase BB)，蛙皮素和神經細胞粘附分子(Neuronal Cell Adhesion Molecule)等，有助于利用免疫組織化學方法來表征這些惡性肺腫瘤，釋放到循環中的這些神經內分泌因子可以作為腫瘤標志物[8-9]。理想的腫瘤標志物不僅可用于早期診斷及預后工具，還能可以反映疾病的進展及其對治療的反應。但上述標志物中沒有一種是肺癌特異性的，且敏感性較差，在其他惡性腫瘤中這些標志物水平也表現為異常，到目前為止，還沒有發現一種理想的標志物，通常需要組合兩種或三種腫瘤標志物，以獲得可接受的靈敏度。目前SCLC中使用最多的腫瘤標志物是NSE，它有助于診斷(75%的患者在診斷時升高)[10]，預后預測及SCLC的隨訪。但NSE的敏感性較低，特別是在LD患者中。在40%的SCLC患者中，CGA水平顯示異常[11]，并且LD患者可能具有更高的敏感性。先前實驗證實ProGRP相比于NSE，對LD和ED具有更高的敏感性[12]。

本研究發現，相比于局限期的SCLC，廣泛期的SCLC患者CGA，ProGRP和NSE水平均顯著增高(P<0.001)，與之前報道的廣泛期的SCLC中ProGRP和NSE水平顯著升高結果一致[13]。此研究還發現，較差的健康狀況PS(2～4)也與血清中NSE，CAG，ProGRP較高的水平相關，該研究結果也與Molina 等研究結果一致。但另一項針對37名SCLC患者的研究發現，根據患者年齡，性別或健康狀況，ProGRP和NSE標記物水平沒有顯著差異，并且只有NSE顯示與疾病等級有關聯(ED患者顯著增加)[14]。

單變量生存分析顯示中位生存時間與以下參數之間存在顯著關聯：PS，疾病分期和血清中ProGRP，NSE和CGA水平。更差的健康狀態，廣泛期的SCLC患者，以及血清中ProPRP >58 pg/mL，CGA >56 ng/mL和NSE >19.0 ng/mL都與中位生存期時間縮短顯著相關。Cox回歸模型發現PS，疾病分期，NSE，CGA和ProGRP水平均為生存的獨立預后指標。

但關于上述標志物的相關研究結果并不一致。ProGRP對用順鉑為基礎的化療治療的SCLC患者沒有預后價值[15-16]，但也有研究發現，ProGRP水平升高導致中位生存期顯著縮短[12,17]。這些差異可能與不同研究使用的不同腫瘤標志物閾值水平有關。例如，一個SCLC系列將其標志物閾值設定為其系列的中位數ProGRP水平(138 pg/mL)；當使用它作為閾值設置時，兩組患者之間的中位生存期沒有顯著差異。然而，當應用更高的閾值截止值 (>800 pg/mL)時，中位生存期差異顯著[18]。因此，首先需要做更多的研究來確定這些神經內分泌標志物是否為良好的SCLC腫瘤標志物，其次是為每種標志物建立適當的閾值水平。此外，本研究為了簡化分析范圍，只是分析相關指標對患者臨床分期以及生存期的影響分析。因生物指標物的變化與具體化療藥物以及方案有關聯，而并未探討其對患者化療效果的影響，因此作為后續研究探究其與化療藥物藥代動力學的相關性。本研究發現，ProGRP，NSE和CGA在SCLC患者的分期和預后存活中都具有潛在的作用。