基于線粒體COⅠ基因序列的中國近海藍圓鲹遺傳多樣性研究

徐 示，章 群，王業磷，裴麗梅，羅 純，黃志基

(暨南大學生態學系，廣州 510632)

藍圓鲹(Decapterusmaruadsi)隸屬鱸形目(Perciformes)鲹科(Carangidae)圓鲹屬，俗稱巴浪、池魚，主要以浮游甲殼類和小型魚類為食，廣泛分布于日本至澳大利亞北部的西太平洋側，是暖水性中上層魚類。藍圓鲹在我國渤海、黃海、東海、南海均有分布，年產量曾一度高達60萬t；魚肉含高蛋白低脂肪，營養價值較高[1-2]，是我國重要的經濟魚類[3-5]。但近年來，受過度捕撈和生態環境破壞的影響，南海北部一些經濟魚類資源嚴重衰退以致難以形成漁汛，而據統計，藍圓鲹2004—2009年全國年均產量約6.2×105t，2010—2018年全國年均產量約為5.6×105t[6]。為防止藍圓鲹逐漸向低齡化、小型化和簡單化等的不利演變，避免重蹈小黃魚(Larimichthyspolyactis)、大黃魚(L.crocea)等種質資源衰退覆轍，亟待制定相應的管理措施，以更好地保護和開發利用中國沿海藍圓鲹種質資源。

遺傳多樣性是生物多樣性與種質資源研究的基礎和核心，遺傳多樣性下降可能導致物種對環境適應力的下降，威脅野外復雜環境下物種的生存[7]。目前，國內外學者對藍圓鲹的研究主要集中在漁業資源利用、生理特性、攝食習性和營養級、形態特征和部分地區生物學分析層面[8-10]。種群遺傳方面的研究，目前僅有牛素芳等[11-12]分別使用控制區全序列標記和Cytb基因標記對福建閩東、閩南2個群體和南海北部灣海域9個群體的藍圓鲹遺傳多樣性分析的報道，尚未見中國東海和黃海等海域的研究。

動物線粒體DNA(mtDNA)進化速度是核基因的4～10倍[13-14]，母系遺傳有效群體數量僅為核基因的1/4，拷貝數多，是開展種群遺傳研究的首選分子標記[15]。其中COⅠ基因已被廣泛用于群體遺傳學和系統發育關系研究[16-19]，線粒體COⅠ序列也被廣泛用于研究不同階元的系統發育關系，如水生生物的群體遺傳學、系統進化、物種鑒定[20]等領域。目前已有大量采用COⅠ基因對不同海洋物種如藍點馬鮫(Scomberomorusniphonius)[21]、印度明對蝦(Fenneropenaeusindicus)[22]、日本紅毛蟹(Erimacrusisenbeckii)[23]等進行的群體遺傳多樣性研究報道，藍圓鲹的線粒體COⅠ基因序列也同樣可很好地用于種群遺傳研究。本研究測定并分析了中國沿海藍圓鲹10個地理群體的COⅠ基因序列多樣性，以期更加全面地了解中國近海藍圓鲹的遺傳多樣性和種群結構，為種質資源的保護和可持續利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集、DNA提取和測序

本研究采集了中國山東、浙江、福建、廣東、廣西、海南6省10個地理群體193尾藍圓鲹(表1)，新鮮肌肉樣品保存于95%乙醇備用。DNA提取采用苯酚-氯仿法[24]，用于PCR擴增的引物、反應體系和反應程序參考WARD[25]的實驗方法，將電泳檢測條帶清晰明亮的PCR擴增產物送華大基因公司測序。

1.2 數據處理

運用MEGA X對測序峰圖人工校對，并計算堿基組成、顛換率，統計突變位點數，基于Kimura2-Parameter模型的遺傳距離構建鄰接樹。通過DnaSP 6.12.03軟件計算單倍型數(number of haplotypes，Nh)、單倍型多樣性(haplotype diversity，Hd )、核苷酸多樣性(nucleotide diversity，π)以及遺傳分化系數(Fst)。使用Network 5.0[26]構建單倍型網絡圖，通過Arlequin 3.5.2.2軟件的分子方差分析(AMOVA)[27]估算群體的遺傳變異，獲得核苷酸錯配信息，檢查組別的顯著性差異，計算Tajima’sD和Fu’sFS值并進行中性檢驗，得到SSD值、Rg值、τ值參數[27]。根據公式T=(τ/2μk)×G，其中，τ、μ、k、T和G依次代表種群擴張時間參數、序列的變異速率[采用1%～3%/MY[28](million year, MY)]、序列長度、代時以及種群擴張時間。使用 BEAST 1. 8. 2 進行種群動態的 Bayesian skyline plot(BSP)分析[29]。

2 結果與分析

2.1 中國近海藍圓鲹群體COⅠ基因序列多態性

測序峰圖經人工校正并去掉兩側引物序列后進行比對，在所獲得193條藍圓鲹COⅠ基因5′端652 bp序列中，A、T、G、C含量分別為22.7%、30.8%、19.7%和26.8%，A+T的含量(53.5%)略高于G+C(46.5%)含量，與其他硬骨魚類的COⅠ堿基特性相一致[30]。在檢測到62個變異位點中有簡約信息位點21個，轉換和顛換比(Ts/Tv)為2.47，表明序列未達到飽和，適合進行種群遺傳發育分析[31]；29個單倍型中，22個為獨享單倍型，其中共享頻率最高的是Hap_1(106個)，由大部分群體共享；其次是Hap_2(54個)，說明二者可能起源于母系祖先的主體單倍型。藍圓鲹整體呈現高單倍型多樣性(0.626 00±0.030 00)和低核苷酸多樣性(0.002 25±0.001 16)的特點，其中舟山群體的單倍型多樣性、嶗山群體的遺傳多樣性最高，分別為0.771 00和0.005 68；新盈群體兩個多樣性數值最低，分別為0.111 00和0.000 17，結果如表1所示。

2.2 中國近海藍圓鲹群體的遺傳分化

以Kimura2-Parameter模型構建的單倍型網絡中呈現典型的星狀結構，沒有明顯的地理聚群和譜系結構(圖1)。表2中兩兩群體間的遺傳分化系數Fst值為-0.040～0.798，其中，北海群體與其他群體Fst值為0.145～0.798且都是極顯著差異；此外，新盈與陵水、惠來、陽江、福州和舟山之間也存在顯著性的遺傳分化(0.006～0.229，P<0.05)[32]。其余組別之間均無顯著差異，不存在明顯分化。

表1 中國沿海藍圓鲹群體的遺傳多樣性Tab.1 Parameters of genetic diversity of D.maruadsi populations in coastal waters of China

注：DX:東興; BH:北海; XY:新盈; DF: 東方; LS: 陵水; YJ:陽江; HL: 惠來; FZ: 福州; ZS: 舟山; LSh: 嶗山

Note: DX:Dongxing; BH:Beihai; XY:Xinying; DF: Dongfang; LS: Lingshui; YJ: Yangjiang; HL: Huilai; FZ: Fuzhou; ZS: Zhoushan; LSh: Laoshan

表2 中國沿海藍圓鲹10個群體間遺傳分化系數(Fst)Tab.2 Fixation index (Fst) of 10 D.maruadsi popalations in coastal waters of China

注：X:東興; BH:北海; XY:新盈; DF: 東方; LS: 陵水; YJ:陽江; HL: 惠來; FZ: 福州; ZS: 舟山; LSh: 嶗山。*：P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001

Note: DX:Dongxing; BH:Beihai; XY:Xinying; DF: Dongfang; LS: Lingshui; YJ: Yangjiang; HL: Huilai; FZ: Fuzhou; ZS: Zhoushan; LSh: Laoshan. Statistical significance:*：P<0.05;**：P<0.01;***：P<0.001

按照地理位置將樣品分為下列3組：①10個地理群體間；②黃海(嶗山)、東海(舟山和福州)、南海(惠來、陽江、北海、東興、新盈、陵水、東方)之間；③臺灣海峽以北(福州、舟山、嶗山)、臺灣海峽以南至北部灣之間(惠來、陽江、北海、東興、新盈、陵水、東方)。AMOVA分析(表3)表明：群體內的變異達到81%以上，組群內群體間變異比列為16.66%～19.49%。上述3個分組：10個群體間(Fst=0.202 50，P<0.001)、3個不同海域間(Fst=0.301 22，P<0.001)、臺灣海峽南北之間(Fst=0.185 21，P<0.001)，都顯示出很高的遺傳分化。

2.3 藍圓鲹的歷史動態

Tajima’sD和Fu’sFS中性檢驗結果見表4。藍圓鲹整體Tajima’sD=-1.326 5(P>0.1)，其中北海、東方、陽江、舟山4個群體為顯著性負值(-2.324 4～-1.684 1，P<0.05)，其余為不顯著性負值。Fu’sFS檢驗東興、惠來和福州是顯著性負值(-3.631 6～-2.552 4，P<0.05)，總體上也是顯著性負值(FS=-1.171 8，P<0.01)。Ramos-Onsins&Rozas’sR2檢驗分析顯示Rg值(0.048 6～0.617 3)和SSD值(0.000 1～0.058 2)較小，且均為不顯著性，表明中國沿海藍圓鲹群體沒有顯著偏離擴張模型。此外，核苷酸錯配圖(圖2)呈現明顯單峰，且觀測分布和期望分布擬合優度較好；Fu’sFS檢驗比Tajima’sD對群體近期擴張更敏感[33]；單倍型網絡圖呈典型星型結構，表明藍圓鲹在歷史上經歷了明顯的快速擴張事件[34]，藍圓鲹整體擴張參數τ為2.912 5，以線粒體COⅠ基因進化速率為(1%～3%)/百萬年[28]、性成熟期1年，估算出中國藍圓鲹種群擴張大約發生在0.226 30～0.075 44百萬年之前，處于晚更新世時期的末次冰期。BSP進一步分析表明，中國沿海藍圓鲹在距今0.21～0.03 Ma BP(圖3)發生過快速的種群擴張事件，這與公式估算得到的種群擴張時間相吻合。

圖1 藍圓鲹單倍型網絡圖Fig.1 Parsimony network of haplotypes of D.maruadsi注：DX:東興; BH:北海; XY:新盈; DF: 東方; LS: 陵水; YJ:陽江; HL: 惠來; FZ: 福州; ZS: 舟山; LSh: 嶗山。不同的填充形式代表不同的種群，圈的大小表示樣本在不同的單倍型出現的頻率Note: DX:Dongxing; BH:Beihai; XY:Xinying; DF: Dongfang; LS: Lingshui; YJ: Yangjiang; HL: Huilai; FZ: Fuzhou; ZS: Zhoushan; LSh: Laoshan. Different filling traits represent different populations,size of circles is approximately proportional to the frequency of each haplotype

表3 中國沿海藍圓鲹種群結構的分子方差分析Tab.3 AMOVA analysis based on mtDNA differentiation of D.maruadsi in coastal waters of China

注：X:東興; BH:北海; XY:新盈; DF: 東方; LS: 陵水; YJ:陽江; HL: 惠來; FZ: 福州; ZS: 舟山; LSh: 嶗山。*：P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001

Note: DX:Dongxing; BH:Beihai; XY:Xinying; DF: Dongfang; LS: Lingshui; YJ: Yangjiang; HL: Huilai; FZ: Fuzhou; ZS: Zhoushan; LSh: Laoshan.*：P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001

圖2 中國沿海藍圓鲹群體COⅠ核酸不對稱分布Fig.2 Distribution of pairwise differences for mtDNA region haplotypes

3 討論

3.1 藍圓鲹的遺傳多樣性和歷史動態

遺傳多樣性是在較長的一段時間積累下的產物，決定該物種生存、發展的前景和進化的方向[35]。物種適應能力、分化能力以及受環境影響的耐受力很大程度上影響了其遺傳多樣性的高低[36]，而單倍型多樣性(Hd)和核酸多樣性(π)是衡量某一物種遺傳多樣性的2個重要指標。藍圓鲹COⅠ序列遺傳多樣性(Hd=0.626 00±0.030 00，π=0.002 25±0.001 16)與牛素芳等[12]報道南海北部的藍圓鲹(Hd=0.577 00±0.036 00，π=0.001 55±0.001 12)在具體數據上略有差異，可能是用于分析的標記基因、序列長度、個體數量和地理群體來源不同所致。但二者都表現為：東部高、西部低。藍圓鲹多樣性呈現出高Hd低π的特點，這與日本比目魚(Paralichthysolivaceus)(Hd=0.736 00±0.053 70，π=0.003 29±0.000 58)[37]、藍點馬鮫(Hd=0.476 00±0.171 00，π=0.001 90±0.000 70)[21]、黃姑魚(Nibeaalbiflora)(Hd=0.697 00±0.002 25,π=0.001 72±0.000 21)[38]表現出相同的多樣性分布模式。而黃海和東海等北方群體核苷酸多樣性高于南海群體，則是本研究擴大地理范圍所得到的新結果。

圖3 藍圓鲹BSP種群動態分析Fig.3 Bayesian skyline plot of D.maruadsi population注：黑線表示中值。陰影區域表示95%的置信區間，所有的ESS≥200Note: The black line indicates the median. The shaded portion represents a 95% HPD interval，all ESS values ≥200

一般而言，遺傳變異和分化較低的物種受到各種不利因素的影響后，其恢復能力較低，甚至會受到滅絕的風險，反之則能很好地適應環境的變化和有較高進化的可能性[39]。北海與其余9個群體之間存在顯著的遺傳分化(0.145～0.798，表2)，新盈與陵水、惠來、福州、舟山之間的群體分化也顯著。AMOVA分析結果顯示，主要變異來源于群體內個體間(變異比例81.745%～91.680%)外，3個分組結果均在組群內的群體間有不同程度的遺傳分化(Fst=0.185 21～0.301 22，P<0.001)。藍圓鲹只在不同季節做或深或淺的游動，而不進行長距離洄游[40]。受南北洋流及大陸架的影響，一方面中國近海北部的藍圓鲹隨中國沿岸流暖流和黑潮穿越臺灣海峽；另一方面南海南部暖流和中國沿岸流到達北部灣，受瓊州海峽和南海大陸架特殊的地理景觀影響[41]，北部灣北海群體和新盈群體難以通過附近洋流和沿岸流進行遠距離傳播，因此可能與其他地理群體間遺傳分化明顯。另外，藍圓鲹在近期整體上發生過種群擴張事件，推測在晚更新世時期的末次冰期，海平面上升，隨著強烈的冬季風增強、南海沿岸流上升，地表古生產力(surface paleoproductivity)增加，使得南北部的藍圓鲹種群得以迅速擴張，產生新的變異[42]。中性檢驗Tajima’sD檢驗法側重于種群的古老突變，因此此檢驗方法能夠反映出較長跨度時間范圍內所發生的事件；Fu’sFS中性檢驗法對種群近期事件更為敏感，因此當種群在近期積累較多變異時，FS往往是較大的負值。本研究中Tajima’sD都是負值，而藍圓鲹整體上的Fu’sFS值出現顯著性負值；單倍型錯配分布呈單峰，也說明藍圓鲹可能在歷史上經歷過種群擴張事件。

3.2 藍圓鲹的種群資源保護

藍圓鲹是我國重要的海洋經濟魚類之一，歷史上產量曾長期位列南海首位，但近年受捕撈強度加大、海洋污染、人為棲息地的破壞和全球氣候變化等多重因素影響，南海藍圓鲹資源量有所下降，其產量也已退居南海魚類第三位，有可能對種質遺傳資源產生不利影響[43-44]。為避免重蹈大黃魚種質資源衰退以致枯竭覆轍，需要加強藍圓鲹種質資源保護和可持續開發利用研究。就本研究而言，南海海域的北海和新盈群體與其他群體間存在較高的分化，可作為一個獨立的管理保護單位，其中新盈群體是遺傳多樣性最低的一個群體，應采取措施避免遺傳多樣性的進一步降低；其余群體作為另一管理保護單位，其中黃海海域的嶗山群體核苷酸遺傳多樣性最高，東海海域的舟山群體次之，應作為藍圓鲹種質遺傳資源保護和開發利用的核心群體。本研究僅使用母系遺傳的分子標記，中國沿海藍圓鲹的雙親遺傳和遺傳分化信息并不能完整地反映。在未來的研究中，將運用多個分子標記進行分析，同時擴大采樣的范圍和增加采樣的數量，以期對中國近海藍圓鲹的遺傳背景做更加深入的了解。