基于網絡藥理和分子對接技術預測熱炎寧合劑抗COVID-19作用△

王梅，唐志書，劉妍如，宋忠興，周瑞，許洪波，于金高，趙夢利，周建平

1.陜西中醫藥大學 附屬醫院，陜西 咸陽 712083；2.陜西中醫藥大學 陜西省中藥資源產業化協同創新中心/秦藥特色資源研究開發國家重點實驗室(培育)/ 陜西省創新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083；3.清華德人西安幸福制藥有限公司，陜西 西安 710043

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在世界范圍內的大規模傳播是2020年初流行病學的重大事件，其危害及規模已超過H1N1流感。雖然目前我國對COVID-19采取了有效的控制措施，使其確診率大大降低；然而，2020年3月9日，世衛組織發布的最新COVID-19情況報告稱，當前COVID-19在全球100多個國家地區蔓延，病例數超10萬，COVID-19成為大流行(病)的威脅已變得非常現實。有研究表明病毒已經出現變異，每個國家病毒的傳染性和毒性有了不同改變，而針對新型冠狀病毒[世界衛生組織(WHO)將其命名為2019 novel coronavirus(2019-nCoV)，國際病毒分類委員會將其命名為severe acute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS-CoV-2)]的疫苗尚未研制成功，有效干預COVID-19的上市藥物也很少，其臨床有效性和安全性仍待觀察。在無明確病因、無特效藥、無疫苗的情況下，我國中醫發揮所長，針對COVID-19“濕、熱、毒、瘀”的核心病機，側重增強機體的抵抗能力和修復能力，不斷開發出“對癥”的復方方劑，為疫情控制提供了有效的防治策略。

熱炎寧合劑是《陜西省新型冠狀病毒感染的肺炎中醫藥治療方案(試行第二版)》中對于治療COVID-19臨床輕、重癥的推薦指定用藥。該制劑由半枝蓮、虎杖、北敗醬和蒲公英組成，具有清熱解毒、消癰散結的功效[1]。為了系統評價熱炎寧合劑對COVID-19的干預作用，篩選其中具有抗2019-nCoV活性的成分。本研究基于中醫藥整體性、系統性的研究策略，采用網絡藥理學方法構建“中藥-成分-疾病-靶點”關聯網絡，從整體預測藥物靶點、作用通路和干預機制，以分子對接技術對抗病毒活性成分進行虛擬篩選，以闡釋其治療作用內涵。

1 資料與方法

1.1 熱炎寧合劑干預COVID-19的可行性

1.1.1化學成分收集與篩選 從中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，http：//www.tcmspw.com)、中國天然產物化學數據庫(http：//www. pharmdata.ac.cn/cnpconline/)中，以熱炎寧中組方中藥蒲公英、虎杖、北敗醬和半枝蓮為搜索詞，收集各組方中藥的主要化學成分[2]。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%或類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18作為進一步篩選條件。

1.1.2“成分-疾病”靶點篩選 從TCMSP、Drugbank(https：//www.drugbank.ca/)、Pubchem(http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫中搜索化合物對應的靶點，以UniProt數據庫(http：//www.uniprot.org/uniprot/)對收集的靶點進行規范化和校正，建立成分相關的基因靶點列表。以“SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome)”“Respiratory Failure”為關鍵詞，在OMIM數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)、MalaCards數據庫(https：//www.malacards.org/)和TTD數據庫(Therapeutic Targets Database，http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)中搜索已報道的與冠狀病毒感染相關的基因。剔除重復和假陽性基因后，建立冠狀病毒感染相關的靶點基因列表。

1.1.3“成分-疾病-靶點”網絡構建 對上述得到的成分相關靶點和疾病相關靶點取靶點交集。將交集內靶點以STRING 11.0數據庫(https：//string-db.org/)，查詢蛋白相互作用信息，構建PPI(Protein to Protein Interaction)網絡，參數設置：種屬為人類(Homosapiens)。

對PPI網絡的蛋白互作信息、“成分-疾病-靶點”及“中藥-成分”信息進行整合，將整理后數據分別Cytoscape 3.7.2軟件，構建“中藥-成分-疾病-靶點”關聯網絡。成分與中藥、疾病和靶點之間的關系用網絡的節點和邊來描述，通過Cytoscape的Network analysis插件來分析并提取網絡節點和邊的特征。

1.1.4生物過程注釋及代謝通路分析 為了闡述熱炎寧合劑與疾病相關成分的靶點在生物過程中的功能的作用機制，以R軟件包(3.6.2)的Cluster profiler包對“成分-疾病-靶點”網絡中的重要靶點進行GO(Gene Ontology)生物信息學富集，以3個本體(Ontology)描述基因靶點的分子功能(Molecular Function，MF)、所處的細胞位置(Cellular Component，CC)和參與的生物過程(Biological Process，BP)[3]；以KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https：//www.kegg.jp/)數據庫富集靶點基因參與的主要生化代謝途徑，并對其關聯關系進行注釋，以P<0.05為顯著性差異判定卡值。采用ggplot2包對GO和KEGG通路富集結果進行可視化處理。

1.2 熱炎寧合劑抗2019-nCoV的活性化合物預測

1.2.1靶點與配體預處理 以上海科技大學饒子和/楊海濤課題組公布的COVID-19 3CLpro高分辨率晶體結構(PDB ID：6LU7)為對接模板，采用Schrodinger-2018軟件的Protein preparation wizard模塊對6LU7結構進行加氫、去水、去雜原子等預處理。以6LU7原配體化合物為參照，以1.1中篩選的活性成分為對接配體，采用Ligprep模塊對各成分結構(*.sdf)進行加氫等優化預處理后生成批量處理文件。

1.2.2分子對接 以原始配體分子為中心，采用Receptor Grid Generation 模塊生成格點文件(盒子大小設為14?)。以6LU7作為剛性受體，熱炎寧合劑活性成分結構作為構象可變化(柔性)配體，進行半柔性對接。由于Docking Score值<-7.0時說明受體-配體間有很高的結合活性，因此對接結果以對接打分值docking core≤-7.0作為篩選條件[4]。

2 結果與分析

2.1 熱炎寧合劑干預COVID-19的網絡構建

2.1.1活性成分篩選 結合TCMSP數據庫和中國天然產物化學數據庫收載的熱炎寧合劑組方中藥成分，一共得到156個成分。OB≥30%或DL≥0.18作為進一步篩選條件，得到符合篩選標準的活性成分49個。

2.1.2“成分-疾病-靶點”篩選 從TCMSP和PubChem數據庫中搜索得到熱炎寧合劑的49個活性成分對應的靶點共有239個，以Uniprot數據庫搜索校正后生成“成分-靶點”集合。從MalaCards數據庫、TTD數據庫和OMIM 數據庫中得到關于冠狀病毒感染誘發的“SARS”和“Respiratory Failure”相關的靶點共計144個，生成“疾病-靶點”集合。將上述得到的“成分-靶點”和“疾病-靶點”集合取靶點交集，并繪制交集維恩圖，得到交集靶點35個(見圖1A)。將交集內靶點以STRING 11.0構建PPI(Protein to Protein Interaction)網絡(見圖1B)，PPI網絡中共有35個節點，264條邊，平均節點數為15.1，平均邊數57條。以k-means法對靶點進行聚類，得到3個分類，以從紅色到藍色表示基因計數(gene count)由大到小。

2.1.3“中藥-成分-靶點”網絡構建分析 將2.1.2篩選得到的35個靶點與中藥進行映射關聯，得到29個化學成分的“成分-靶點”關聯表，與PPI互作表一同導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建熱炎寧合劑的“中藥-化合物-靶點”關聯網絡。如圖1C所示(紅色：活性化合物；綠色：靶點；藍色：組方中藥)，所構建的關聯網絡包括68個節點(4種中藥，29個成分，35個靶點)和480條邊。網絡圖中以節點大小表示度數大小，度數的大小代表該節點在網絡中的重要性；接近中心度大小表示節點在網絡中的中心度。該網絡中成分度值較大，接近中心度>0.45的化合物為槲皮素(度數=42)、木樨草素(度數=45)、蒲公英萜酮(度數=24)、β-谷甾醇(度數=12)和芹菜素(度數=12)。網絡中度數較大，接近中心度>0.45的靶點為環氧化酶1(PTGS1)(度數=38)、腫瘤壞死因子(TNF)(度數=33)、白細胞介素6(IL6)(度數=33)、白細胞介素10(IL10)(度數=32)、白細胞介素1β(IL1B)(度數=30)和C-C趨化因子配體2(CCL2)(度數=28)等15個靶點。相比其他3個中藥，該網絡中半枝蓮度數(度數=49)和接近中心度數值(0.47)較大，說明半枝蓮是熱炎寧合劑在干預COVID-19中較為重要的組方中藥，其主要成分木樨草素、芹菜素和β-谷甾醇可通過作用于PTGS1(度數=38)、IL6(度數=33)和IL10(度數=32)發揮作用。其次，虎杖在網絡中度值(度數=40)和接近中心度(0.40)也較高，其主要成分槲皮素、木樨草素和β-谷甾醇可作用于PTGS1、IL6、IL10、IL1B和CCL2發揮作用。以上結果表明熱炎寧合劑在干預COVID-19的過程中具有多成分、多靶點的協同作用。

2.1.4熱炎寧合劑干預COVID-19的生物信息富集及代謝通路注釋 將“中藥-成分-疾病”網絡中篩到的對應的15個靶點通過Cluster profiler進行生物信息學GO富集分析和KEGG通路注釋，共富集到24條生物學過程，7條代謝通路。GO富集分析結果，見圖2，這些靶點主要分布于細胞外空間(GO：0005615，extracellular space)和質膜外側(GO：0009897，external side of plasma membrane)。其MF主要與細胞因子活性(GO：0005125，cytokine activity)、細胞因子受體結合(GO：0005126，cytokine receptor binding)、分子功能調節劑(GO：0098772，molecular function regulator)、生長因子受體結合(GO：0070851，growth factor receptor binding)和趨化因子活性(GO：0008009，chemokine activity)有關。BP主要涉及信號轉導受體活性的調節(GO：0010469，regulation of signaling receptor activity)、對脂多糖的反應(GO：0032496，response to lipopolysaccharide)、炎癥反應(GO：0006954，inflammatory response)、防御反應(GO：0006952，defense response)和免疫系統過程的正向調節(GO：0002684，positive regulation of immune system process)。這些靶點主要參與的代謝通路為：細胞因子受體相互作用通路(hsa04060，Cytokine-cytokine receptor interaction)和IL-17信號通路(hsa04657，IL-17 signaling pathway)。

注：A.“成分-疾病”靶點交集韋恩圖；B.篩選靶點PPI圖；C.“中藥-成分-靶點”關聯圖(藍色為中藥；紅色為成分；綠色為靶點)。圖1 熱炎寧合劑“中藥-成分-疾病-靶點”網絡關聯圖構建

2.2 熱炎寧合劑中潛在2019-nCoV 3CL pro(PDB ID：6LU7)抑制劑篩選

2.2.1對接體系驗證 通過將對接前后的6LU7原始配體進行構象疊合來驗證對接體系的準確度，結果顯示均方根偏差(RMSD)值為1.281 3? < 2?，說明該對接體系適用于配體成分與受體6LU7的半柔性對接。

2.2.2熱炎寧合劑化合物對接測試 將“中藥-成分-疾病-靶點”網絡中的29個化合物與對接體系(包括6LU7預處理受體和格點文件)進行對接測試，以對接打分值 ≤-7.0作為篩選條件，結果得到符合篩選標準的化合物7個，具體信息見表1，對接結果表明，大部分化合物主要和受體結合位點發生氫鍵作用，且這些化合物主要為黃酮類化合物，其結合主要為4位羰基氧和GLU166形成氫鍵，7位和4′位羥基分別和LEU141、CYS145、ASP187形成氫鍵(見圖3)。中藥歸屬顯示，這7個化合物主要歸屬為半枝蓮，說明該中藥可能是熱炎寧合劑中發揮抗病毒作用的主要中藥，說明熱炎寧合劑中干擾病毒復制的有效成分主要來自于半枝蓮的黃酮類化合物。

圖2 熱炎寧合劑靶點GO富集及KEGG通路注釋

3 討論

熱炎寧合劑由半枝蓮、虎杖、北敗醬和蒲公英組方而成。方中半枝蓮味辛、苦，歸肺、肝、胃經，以清熱解毒見長，又具化瘀利尿之效。虎杖性微寒，味微苦。歸肝、膽、肺經，具有祛風利濕、止咳化痰的功效，又可利濕破瘀。北敗醬微寒，味苦，歸大腸、肝經，既可清熱解毒，又可活血化瘀；蒲公英性寒，味甘、苦，具有清熱解毒，利尿散結的作用。四藥協同為用，既可針對發熱、咳嗽發揮清熱解毒、止咳化痰的功效，又可針對并發癥發揮利濕破瘀、活血散結的功效。目前，陜西省傳染病醫院(西安市第八醫院)、西安交通大學第二附屬醫院、湖北省松滋市人民醫院等多家醫院已將熱炎寧合劑作為治療COVID-19的臨床一線制劑。

注：橙色球棍模型為候選化合物分子；藍色為氮原子；紅色為氧原子。圖3 6LU7與熱炎寧合劑活性化合物相互作用圖

表1 熱炎寧合劑活性化合物對接、篩選結果及關聯中藥分析

對接成分對接打分化學成分相對分子量中藥MOL000008-8.051芹菜素apigenin270.25半枝蓮、虎杖、北敗醬、蒲公英MOL012251-7.638白楊素甲醚chrysin-5-methylether268.28半枝蓮MOL012249-7.5287,2′-dihydroxy-5,8-dimethoxyflavone314.31半枝蓮MOL001040-7.455(2R)-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one272.27半枝蓮MOL012250-7.4417-hydroxy-5,8-dimethoxy-2-phenyl-chromone298.31半枝蓮MOL012247-7.3775,7-dihydroxy-8-methoxy-2-(2-methoxyphenyl)chromone314.31半枝蓮MOL000492-7.069兒茶素catechin290.29虎杖、北敗醬、蒲公英

盡管已有大量臨床研究、病理學、分子生物學研究證明了熱炎寧合劑對呼吸系統感染的有效性，其作用機制仍然未有闡明[5-8]。因此，本研究通過對熱炎寧合劑“中藥-成分-疾病-靶點”網絡進行網絡拓撲學分析發現，熱炎寧合劑中的活性成分與冠狀病毒感染誘發的“急性呼吸綜合征”的15個靶點相關。其中，CCL2、CD40LG、CXCL10、CXCL8、IFNG、IL10、IL13、IL1B、IL2和IL6在關聯網絡中占有重要地位。靶點生物信息學的富集結果顯示，熱炎寧合劑中的活性成分可能通過參與多種生物途徑發揮干預COVID-19的作用，主要涉及細胞因子受體相互作用通路和IL-17信號通路，這些生物過程與病毒感染造成的“細胞因子風暴”密切相關。細胞因子風暴易導致肺上皮細胞和肺血管內皮細胞的損傷，引起急性肺損傷(ALI)的病理改變，出現肺血管通透性增高、肺水腫等臨床表征[9-11]。已有研究根據《新型冠狀病毒肺炎診療方案》中醫治療方案對COVID-19臨床輕、中度的病癥表現，建立了模擬人類COVID-19的動物模型，對熱炎寧合劑的有效性進行了實驗性評價。研究結果顯示，熱炎寧合劑能顯著降低模型動物的肺指數、肺組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)含量及血清胃動素含量，能夠顯著提升外周血CD8+T淋巴細胞和CD4+T 淋巴細胞百分比[12]。

以上研究說明熱炎寧合劑在改善2019-nCoV感染導致的急性炎癥及機體過度免疫反應方面有很好的潛力，具有“治標”作用。同時本研究也對熱炎寧合劑中可能干擾病毒復制的化合物進行了篩選，以期找到“治本”的關鍵信息。因此，本研究以2019-nCoV復制過程中的重要水解酶3CLpro為對接靶點，以“成分-疾病-靶點”網絡中的24個關鍵化合物作為配體，采用分子對接技術篩選得到7個對3CLpro有潛在抑制作用的化合物，說明這些化合物在發揮抗COVID-19作用的同時，也具有抗病毒的潛力(見圖4)。

注：綠色為中藥；橙色為成分；藍色為靶點；紫色為KEGG代謝通路。圖4 熱炎寧合劑干預COVID-19的“成分-靶點-通路”預測網絡

綜上所述，本研究對熱炎寧合劑干預COVID-19的活性成分、靶點及通路進行了探索性研究，并篩選了抗2019-nCoV的活性成分。分析結果初步表明，熱炎寧合劑組方的半枝蓮和虎杖是“中藥-成分-靶點-通路”網絡中的重點中藥，其黃酮類成分如芹菜素、白楊素甲醚等是抗炎、抗病毒的主要成分。綜合代謝通路注釋結果說明熱炎寧合劑可通過多成分、多靶點、多通路的互作模式達到兼顧“治標”和“治本”的治療作用。