基于分子對接和網絡藥理學技術預測銀翹解毒合劑防治新型冠狀病毒肺炎的可行性△

許洪波，劉妍如，周瑞，于金高，楊寧娟，王梅，黃峰，宋忠興，唐志書*

1.陜西中醫藥大學 陜西省中藥資源產業化省部共建協同創新中心/ 秦藥特色資源研究開發國家重點實驗室(培育)/陜西省創新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083；2.陜西中醫藥大學 附屬醫院 國家中醫臨床研究基地，陜西 咸陽 712000；3.陜西中醫藥大學 制藥廠 陜西省博士后創新基地，陜西 咸陽 712083

2019年末至今，一場由新型冠狀病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2)引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)肆虐全球，目前全世界已有數萬人被2019-nCoV感染。該病毒是迄今第7種可感染人類的冠狀病毒，其引發的重癥病例和病死率較高[1-3]。目前為止還沒有針對2019-nCoV的特效藥；因此，根據冠狀病毒結構及其致病機理尋找高效、低毒、靶向的藥物，是目前中國和國際醫藥界的當務之急。

中醫的整體觀念與辨證論治特點在歷次新突發傳染病的防治中均發揮了獨特作用[4-6]。從中醫的角度分析，此次COVID-19可歸于溫病范疇，因其傳染性較強，又屬溫疫[7]。在數千年中華文明史上，中醫藥學對于瘟疫診治已積累了豐富的臨床經驗，形成了衛氣營血辨證、三焦辨證以及六經辨證等多種辨證論治理論體系[7]。中醫治療的優勢是即使不明確病原體，仍然可以在辨證論治理論的指導下，根據許多既定的證候類型，參照傳統的理法方藥進行治療。基于中醫藥在新突發傳染病防治中的獨特作用，國家衛生健康委將中醫治療納入《新型冠狀病毒肺炎診療方案》，并提出了該病的中醫病因、病機和治則。經過近1個月的臨床實踐證明，中醫藥對治療此次COVID-19確實有療效[5]。

分子對接技術是一種重要的計算機輔助藥物分子設計手段，它通過化學計量學方法研究蛋白質受體和藥物分子之間空間、能量和化學環境匹配情況，可闡明和預測藥物的作用效果和機制[9]。近年來，分子對接技術已成為中藥研究領域的一項常用技術[10-11]，特別是對中藥藥效物質基礎的高效、快速篩選研究有重要意義。網絡藥理學整合了系統生物學、多向藥理學(polypharmacology)、計算生物學和網絡分析等學科，從整體角度探索中藥與疾病間的關聯性，契合于中藥多成分-多靶點的作用關系，與中藥從整體水平調控機體并發揮治療作用的觀點相吻合，從而提供了一種從系統水平探尋中藥及其復方潛在活性成分的新策略[3]。

本研究運用分子對接和網絡藥理學技術研究銀翹解毒合劑防治病毒性肺炎可能的物質基礎和起效路徑，為銀翹解毒合劑用于COVID-19的防治提供參考。

1 方法

1.1 銀翹解毒合劑所含化學成分收集

使用計算系統生物學實驗室平臺(TCMSP，http：//tcmspw.com/)、Collective Molecular Activities of Useful Plants(CMAUP，http：//bidd2.nus.edu.sg/CMAUP/)及PubChem數據庫，分別收集金銀花、連翹、桔梗、荊芥、薄荷、牛蒡子、淡豆豉、淡竹葉和甘草中已報道的化學成分。

1.2 分子對接

以銀翹解毒合劑中的成分為配體，以血管緊張素轉換酶Ⅱ(ACE2)蛋白為受體，進行分子對接虛擬篩選，對接主要通過Discovery Studio (DS)軟件完成。

1.2.1對接受體的準備 本研究蛋白靶點ACE2 的晶體結構獲取自RCSD蛋白質數據庫 (PDB：2ajf)，并按照以下步驟對蛋白晶體進行預處理：1)刪除水分子、原配體分子及非相關的蛋白質構象；2)經Prepare Protein工具處理；3)基于文獻報道的該受體可能結合域定義結合位點Sphere；4)保存備用。

1.2.2配體的準備 將所收集的成分結構去重后，保存成sd格式文件，導入DS軟件中，運行Prepare Ligands工具，對配體加氫、生成優勢構象，保存結構備用。

1.2.3分子對接 分別打開準備的受體和配體文件，按照DS軟件對接流程進行分子對接。LibDock對接參數設置為：Docking Tolerance 0.25，Max Hits to Save 100，Conformation Method FAST，其他參數為默認設置。從對接結果中選取Docking打分函數LibDockScore得分最高者，分析其相互作用。CDOCKER對接參數設置為：Top Hits 10，Dynamics Steps 1000，Dynamics Target Temperature 1000，Maximum Bad Orientations 800，Orientation vdW Energy Threshold 300，Heating Steps 2000，Heating Target Temperature 700，Cooling Steps 5000，Cooling Target Temperature 300，Forcefield CHARMm。

傳統的教學模式是學生在教室里“群體”聽課，教師講解的難易程度與學生所能接受的程度常常不能完全一致。領悟快的學生聽了一次課就掌握了新知，上課走神或領悟慢的學生則會出現聽不懂的現象，因此，只能盡量保證大部分學生的學習，很難做到讓每一位學生都聽懂且掌握。

1.3 關鍵活性成分及其靶標蛋白的篩選

中藥多為口服制劑，在體內需經過吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)及排泄(excretion)過程到達靶點器官、組織發揮作用，即ADME過程。其中口服生物利用度(OB)是藥物ADME過程中重要的藥動學參數之一，它表示口服藥物的有效成分或活性基被吸收到達體循環并吸收的速度與程度。此外，化合物類藥性(DL)是指化合物與已知藥物的相似程度，DL≥0.18則認為該化合物與Drugbank數據庫里藥物具有一定的相似性。因此，為了從銀翹解毒合劑活性化合物群中篩選到關鍵活性成分，設定OB≥30%，DL≥0.18作為閾值進行過濾篩選，獲得關鍵活性成分，并通過TCMSP、Drugbank等數據庫獲取相關靶標蛋白。

1.4 關鍵活性成分-靶點網絡構建與分析

將篩選得到的銀翹解毒合劑中關鍵活性成分及其對應的靶標，導入 Cytoscape 3.7.2軟件，構建活性成分-靶點網絡，利用Cytoscape軟件的Network Analyzer工具計算網絡拓撲參數，包括度值(Degree)、介數(betweenness centrality，BC)等。

1.5 靶點生物學功能富集分析

通過R軟件包中的Cluster profiler模塊對關鍵成分的潛在作用靶點進行GO (Gene Ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路富集分析，以P<0.05為指標對結果進行篩選分析，使用R語言對結果進行可視化處理。

2 結果

2.1 成分收集

通過網絡數據庫收集到金銀花、連翹、桔梗、荊芥、薄荷、牛蒡子、淡豆豉、淡竹葉和甘草中的成分結構分別為236、150、102、164、144、15、19、280個，共計1269個化合物，去掉重復結構后共有1060個化合物。

2.2 分子對接結果

將收集的1060個中藥成分，以ACE2為靶蛋白，進行分子對接。計算結果表明：銀翹解毒合劑中化合物的LibDockScore得分最大值為221.368，得分排名前10的化合物分別為：去芹菜糖基-桔梗皂苷-D3(deapio-platycodin-D3)(221.368)、遠志皂苷D2(polygalacin D2)(211.283)、3′-α-O-遠志皂苷D(3′-α-O-polygalacin D) (208.178)、連翹種苷B(suspensaside B)(194.921)、桔梗皂苷G1(platycoside G1) (186.793)、連翹酯苷B(forsythoside B)(183.393)、3′-O-遠志皂苷D(3′-O-polygalacin D)(182.998)、甘草糖苷E(licorice glycoside E)(178.568)、連翹脂苷C(forsythoside C)(178.038)、連翹屬苷(forsythiaside)(176.095)。所有參與分子對接的成分中，有18個化合物的LibDockScore值比參照藥物洛匹那韋高 (LibDockScore>165.002)，有40個化合物比瑞德西韋高(LibDockScore>152.993)(見表1)。此外，共有301個成分的LibDockScore值>100(LibDock分子對接的打分函數LibDockScore是基于配體與受體對接時的親和力、相對能量和對接模式等進行綜合打分，一般認為LibDockScore>100即表明受體與配體結合較好，其值越大則表明對接產生的復合物構象越穩定，配體與受體的親和作用越好[12])。

表1 LibDock分子對接排名前40的化學成分

注：—表示未進行CDOCKER研究。

為進一步評估和驗證這40個化合物與ACE2蛋白的作用，我們采用CDOCKER方法對其進行研究。CDOCKER是基于CHARMm力場的分子對接方法，它采用高溫動力學搜索配體分子的柔性構象，進而針對各配體構象用模擬退火的方法優化其與受體活性位點的作用，這種方法可以產生高精度的對接結果。CDOCKER實驗結果表明，這40個化合物的-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY值均為正數，且該值基本都高于參照化合物洛匹那韋(48.210 kcal·mol-1)和瑞德西韋(43.005 kcal·mol-1)，提示這些化合物與受體蛋白具有較好的親和作用。

2.3 結合模式分析

根據上述分子對接結果，對表1中LibDockScore得分最高的2個化合物去芹菜糖基-桔梗皂苷-D3和遠志皂苷D2與ACE2蛋白對接的作用模式進行分析。ACE2蛋白與這2個化合物相互作用的2D和3D圖見圖1。由圖可知，2個配體均結合于ACE2蛋白的空腔內，且與受體之間主要通過氫鍵作用穩定結合。所不同的是，去芹菜糖基-桔梗皂苷-D3可與受體蛋白中ASN394、LYS562、GLY395、ARG514、ASP206、TYR515、ARG518、HIS374、GLU398殘基形成氫鍵作用，產生穩定結合。遠志皂苷D2主要與受體蛋白中TYR202、ASP206、LYS562、GLY395、GLU398、ARG514殘基形成氫鍵作用，其他殘基如TYR510、HIS378等，可與配體形成較強的疏水堆積作用，有利于其結合。

2.4 銀翹解毒合劑抗冠狀病毒的關鍵活性成分篩選

上述通過分子對接篩選得到的潛在活性化合物，盡管有較高的LibDockScore值，但通過檢索發現，很多成分的OB和DL較差。

注：A.去芹菜糖基-桔梗皂苷-D3與ACE2蛋白結合3D模式；B.去芹菜糖基-桔梗皂苷-D3與ACE2蛋白相互作用2D圖；C.遠志皂苷D2與ACE2蛋白結合3D模式；D.遠志皂苷D2與ACE2蛋白相互作用2D圖。圖1 代表性化合物去芹菜糖基-桔梗皂苷-D3和遠志皂苷D2與ACE2蛋白作用模式

因此我們根據系統藥理學通用的活性成分篩選標準(OB≥30%且DL≥0.18)[3-5]，借助TCMSP數據平臺，從LibDockScore得分>100的成分中篩選出符合標準的化合物，建立關鍵活性成分集合。最終從301個成分(LibDockScore>100)中篩選到關鍵活性成分55個，詳細信息見表2。

表2 銀翹解毒合劑中潛在抗冠狀病毒的關鍵活性成分

續表2

2.5 關鍵活性成分-靶點網絡構建與分析

通過PubChem、TCMSP等數據庫檢索，收集整理55個關鍵活性成分的相關靶點123個。運用Cytoscape軟件構建銀翹解毒合劑關鍵活性成分-靶點網絡，見圖2。圖中共包含166個節點和502條邊線，其中化合物節點43個(12個化合物未參與網絡構建)，蛋白靶點節點123個。該網絡拓撲學性質分析表明：平均每個化合物與11.67個靶點相互作用，每個靶點平均與4.08個化合物相互作用，因此在銀翹解毒合劑中也存在多個化合物同時作用于同1個靶點且單個化合物又作用于多個靶點的現象。從化合物角度來看，有7個化合物(16.28%)的作用靶點超過20個，分別為蘆丁、β-谷甾醇、豆甾醇、4′-甲氧基光甘草定、新疆甘草紫檀素(shinpterocarpin)、粗毛甘草素C和β-胡蘿卜素。從靶點的角度來看，有6個靶標(4.88%)的Degree≥20，有18個靶標與不少于10個化合物相互作用，其中等級值排名前5的靶標為：PTGS2(Prostaglandin G/H synthase 2)、NCOA2 (Nuclear receptor coactivator 2)、HSP90AA1 (Heat shock protein HSP 90)、PCP4 (Calmodulin) 和F7 (Coagulation factor VII)；其中大部分靶點蛋白能夠調控炎癥、細胞凋亡以及免疫反應等生物過程。

注：綠色菱形節點為關鍵活性化合物；藍色方形節點為靶點。圖2 銀翹解毒合劑中潛在抗冠狀病毒的關鍵活性成分-靶點網絡

2.6 關鍵活性成分作用靶點生物學功能分析

為深入了解上述關鍵化合物作用靶點的生物學功能，對這些靶點進行了GO 富集分析與KEGG通路分析。GO富集分析得到了P<0.05的GO條目共計2080個，其中包含生物過程(biological process，BP)條目1862個，細胞組成(cell composition，CC)條目88個，分子功能(molecular function，MF)條目130個，各類別前20的條目分別見圖3～5。

KEGG通路分析得到了P<0.05的通路152條(前20條通路結果見圖6)，其中富集的主要通路包括了與COVID-19感染源類似(病毒感染)的疾病，如卡波濟氏肉瘤皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染、乙肝病毒、丙肝病毒、EB病毒感染、A型流感病毒等；以及PI3K-Akt信號傳導通路、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、IL-17信號傳導通路、T細胞受體信號傳導通路等已報道與肺炎和免疫反應、炎癥反應相關的信號通路[13]。

圖3 GO-BP富集分析結果

圖5 GO-MF富集分析結果

圖6 銀翹解毒合劑中潛在抗冠狀病毒的關鍵成分作用靶點KEGG通路富集分析

綜合通路富集分析結果可知，從銀翹解毒合劑中篩選出的關鍵活性成分可能對病毒感染以及肺部損傷有一定的作用。該結果與分子對接實驗一致，可互為佐證，同時也揭示了銀翹解毒合劑臨床防治COVID-19可能的起效環節。

3 討論

銀翹解毒合劑處方源于溫病名方銀翹散；該方出自《溫病條辨》，是吳塘 (鞠通) 論治溫病所創，被譽為治療溫病第一方[14]，具有辛涼化濕、疏散風熱、清熱解毒之功效。該方以金銀花、連翹為君藥，既有辛涼透邪清熱之效，又具芳香辟穢解毒之功；荊芥、豆豉辛溫不燥能助君藥透散表邪，又能防止寒性藥物涼遏太過，而致表邪難解；薄荷、牛蒡助君藥疏散風熱，共為臣藥；淡竹葉、蘆根清熱生津；桔梗、甘草宣肺利咽止咳，均為佐藥，其中甘草調和諸藥，兼為使藥。銀翹解毒合劑配伍具有內清熱毒、外散風熱、透解表邪之功，構成清疏兼顧之劑。該方主要針對溫病初起衛分證及風熱表證；溫病初起，邪在衛分，衛氣被郁，開合失司，則發熱，微惡風寒，無汗或有汗不暢，風熱襲肺以致咳嗽咽痛，溫邪易傷津液，故口渴，舌尖紅，邪在衛表，故舌苔薄自或薄黃。現代研究表明，該方用于治療風熱感冒、流感的療效顯著[15-16]。

COVID-19屬于中醫學溫病范疇，病機為疫毒犯肺，起始邪在肺衛，入里化熱為重要病機轉歸。此疾具有伏邪治病特點，疫毒伏藏體內，因人稟賦不同，可即刻起病，也可伏藏體內，殆至機體免疫功能低下而發病，具有濕、熱、毒之性，臨床治療應化濕清解。COVID-19的發病特點、臨床癥狀、中醫證候及傳變規律等與銀翹解毒合劑所治諸癥符合，因此，從中醫理論方面來看，銀翹解毒合劑的確可以作為防治早期新冠肺炎的首選方之一。同時我們認為，新冠肺炎進入危重期后，病情復雜，變證叢生，臨床治療上需要采取更加個體化的方式。

研究顯示，2019-nCoV與感染途徑一致，均通過其表達的S-蛋白與人體內ACE2結合，導致病毒侵入機體而致病[4，17-18]。重要的是，同源性建模表明2019-nCoV與ACE2受體的結合域與SARS-CoV結構相似，盡管它的受體結合域中存在氨基酸突變，多個氨基酸發生了變化，但變化后的氨基酸卻在整體性上完美地維持了病毒S-蛋白與ACE2受體相互結合構象的穩定性[19-21]。因此，能作用于ACE2特異性位點的小分子，就有可能阻斷2019-nCoV S-蛋白與宿主ACE2的結合，從而達到防治2019-nCoV的目的。為此，本研究主要針對2019-nCoV感染過程的關鍵靶蛋白ACE2，通過分子對接篩選銀翹解毒合劑抗2019-nCoV的潛在分子。對接結果表明，銀翹解毒合劑中有301個成分與ACE2蛋白具有較好的親和作用，其中作用較好的化合物主要為桔梗中的皂苷和連翹中的酯苷等類成分。此前已有研究顯示桔梗皂苷和連翹酯苷確有較好的抗呼吸道病毒作用[22-25]，提示虛擬篩選的結果與此前的實驗結果具有較高的一致性。

基于對活性成分ADME性質的考慮，我們對虛擬篩選所得活性成分進行進一步篩選，從中得到關鍵活性成分55個，這些成分生物利用度較高、類藥性較好，可能是銀翹解毒合劑防治COVID-19的物質基礎。為了探討關鍵活性成分防治COVID-19的復雜路徑，本研究采用網絡藥理學技術對關鍵成分及其靶標進行了深入挖掘和網絡分析。從網絡藥理學分析結果可知，銀翹解毒合劑中關鍵成分通過多成分、多靶點、多途徑形式調控疾??；重要的是這些關鍵成分作用的通路包含了與COVID-19致病源類似的病毒感染性疾病，及與肺炎、免疫和炎癥反應相關的信號通路；進一步表明這些關鍵成分可能對2019-nCoV有抑制作用、對COVID-19有防治作用；同時也佐證了分子對接的結果。

總之，本研究應用分子對接和網絡藥理學方法對銀翹解毒合劑中防治病毒性肺炎的物質基礎及可能起效環節進行了探討。研究結果提示銀翹解毒合劑用于COVID-19的防治具有一定的合理性。

但也應當注意，目前對病毒本身及感染治病機制認知尚存不足，計算化學生物學方法本身存在局限性等，因此可能會存在計算結果與實際臨床療效不符的現象；針對上述問題，可圍繞物質基礎-藥效學-通路驗證等開展實驗研究，同時進行臨床藥效觀察，為銀翹解毒合劑防治COVID-19提供更堅實的依據。