基于DNA條形碼的藏藥洪連鑒定研究△

尼瑪潘多，李婷，胡小松，劉春生*

1.西藏自治區食品藥品檢驗研究院 西藏自治區藏藥標準化研究重點實驗室，西藏 拉薩 850000；2.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488

洪連為藏族習用藥材，始載于《四部醫典》。《鮮明注釋》云：“洪連門巴隨處皆有”；《度母本草》云:“洪連門巴產自南方者為上品；下品分雌、雄兩類：能開花者為雄，無花者為雌。”《圖譜》云：“雌洪連生于草坪和海濱，葉厚而具皺紋，下垂；花白色，狀如狼尾巴；根如松雞糞，枝被長毛。”《藍琉璃》云：“隨處皆生，分雌雄兩種，雄者花藍色，狀如松雞糞；根狀如蟲。”《甘露本草明鏡》云：“本品根呈灰色，圓錐形，具須根；葉綠色，厚具皺紋，微粗糙，葉背微灰色，卵形或劍形，邊緣有鋸齒，先端急尖或鈍圓；葉柄紫紅色，細面長；花紫紅色，果實小，黃紫色。”各地藏醫多用玄參科的兔耳草、短管兔耳草、全緣兔耳草等植物為洪連門巴，其中，短管兔耳草的形態特征與上述文獻記載更相近，故為兔耳草的正品[1]。具有清熱解毒、行血調經的作用，在傳統藏醫中用于治療全身發熱、腎炎、肺病、高血壓、動脈粥樣硬化、月經不調、綜合物中毒及“心熱”等癥[2]。洪連在臨床上的應用較為廣泛，是不少藏成藥的主要組成，如二十味沉香丸、二十五味大湯丸、二十六味通經丸、八味沉香利尿丸、二十五味獐芽菜丸等。

2015年版《中華人民共和國藥典》收載的洪連為玄參科短筒兔耳草LagotisbrevitbaMaxim.的干燥全草，1995年版《中華人民共和國衛生部藥品標準》藏藥第一冊收載玄參科短管兔耳草LagotisbrevitubaMaxim或全緣兔耳草LagotisintegraW.W.Smith的干燥全草，《云南省中藥材標準》1996年版收載革葉兔耳草LagotisalutaceaW. W. Smith.全緣兔耳草LagotisintegraW.W.Smith的干燥全草。

但各地藏區(西藏、四川、青海、云南、甘肅)除使用上述標準規定的品種外也有使用其他種的兔耳草。鑒于洪連藥材來源復雜，品種繁多，極易造成藥材混亂，加之兔耳草屬的植物形態相似，不能準確區分。因此，對兔耳草屬藥材進行準確鑒定有著非常重要的意義。

目前對兔耳草的研究多集中在對短筒兔耳草的研究，且對其化學成分[3-7]研究較多，未見其有采用DNA條形碼對其鑒定的報道。近年來，DNA條形碼越來越受到關注。與傳統鑒定方法相比，DNA條形碼技術以物種的遺傳信息為鑒定依據，不受植物生長環境、發育階段、樣品形態和組織部位的限制，具有通用性、客觀性、準確性等特點[8]。因此DNA條形碼已經廣泛應用于藥材鑒定的各個領域，如植物藥、動物藥等。

本研究收集了12批來源于各藏區的洪連藥材，采用ITS及其葉綠體序列對其進行DNA鑒定，旨在對洪連進行準確鑒定，為進一步藏藥資源的開發與合理利用提供支持。

1 材料

1.1 儀器

BIO-RAD T100 Thermal Cycler PCR儀(德國Biomerta公司)，Bio-Rad 型電泳儀，(北京六一儀器廠)，JY-SPDT型水平電泳槽(北京君意東方電泳設備有限公司)，BG-gdsAUTD520凝膠成像分析系統(南京華奧儀器有限公司)，MM400冷凍混合球磨儀(德國RETSCH公司)。

1.2 試藥

廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒(TIANGEN)，2×Taqplus per mastermix(含染料)(北京博邁德發展有限公司)；樣品收集于各藏區，具體樣品信息見表1。其中11、12號樣品由四川省食品藥品檢驗檢測院黎躍成老師提供，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定為玄參科兔耳草屬植物。

表1 12份洪連樣品信息

2 方法

2.1 DNA提取

取適量藥材用75%乙醇進行表面擦拭，加入液氮，用球磨儀迅速將其研成粉末，采用光譜植物基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，具體操作見說明書。提取的樣品DNA于-20 ℃保存備用。

2.2 PCR擴增

采用30 μL反應體系，樣品總DNA 2 μL，正反向引物(ITS引物：F-5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，R-5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；psbA-trnH引物：F-5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′R-5′-CGCGCA-TGGTGGATTCACAATCC-3′；引物各1 μL，2×Mix聚合酶15 μL，ddH2O補足。

PCR反應程序：ITS序列：94 ℃ 3 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30個循環，至72 ℃ 5 min；psbA序列：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共30個循環，至72 ℃ 7 min。

2.3 測序分析

將所得PCR產物經1.0%～1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下檢測于500～750 bp可見單一明亮的條帶。剩余PCR產物經北京小師弟商貿有限公司進行一代測序分析。

2.4 數據處理

測序結果進行ContigExpress進行正反拼接，DNAMAN拼接及序列比對，采用BLAST方法對獲得的DNA序列在GenBank-NCBI中進行相似性同源查詢，采用MEGA5.0對得到的序列進行比對，分析種內、種間的遺傳變異，計算Kimura2-parameter(K2-P)遺傳距離，構建NJ進化樹。

3 結果

3.1 ITS序列數據分析結果

經DNAMAN多序列比對，序列總長552 bp，各序列相似度達到97.43%，存在34個變異位點，見表2。從表中可得出在107 bp時短管兔耳草無堿基，全緣兔耳草為堿基T，紫葉兔耳草為堿基A，故能將三者進行區分。

根據其遺傳距離構建N-J樹，由圖1可知，1、2、5、9、10共5個樣品與下載序列短筒兔耳草聚為1支，3、4、7、8、11、12共6個樣與全緣兔耳草聚為1支，6號樣與紫葉兔耳草聚為1支。

圖1 洪連樣品ITS N-J樹

3.2 psbA-trnH序列數據分析結果

序列長度約為250 bp，存在12個變異位點，見表3。在136 bp處，全緣兔耳草為堿基T，紫葉兔耳草為堿基A，短筒兔耳草無堿基，因此能將3個種很好地區分。根據遺傳距離構建N-J樹。由圖3可知，與ITS結果鑒定結果相同，1、2、5、9、10共5個樣品與下載序列短筒兔耳草聚為1支，3、4、7、8、11、12共6個樣與全緣兔耳草聚為1支，6號樣與紫葉兔耳草聚為1支。

表2 ITS序列變異位點

注：A .腺嘌呤；T.胸腺嘧啶；C.胞嘧啶；*表示在此處未有堿基。

表3 psbA-trnH序列變異位點

注：A .腺嘌呤；T.胸腺嘧啶；C.胞嘧啶；G.鳥嘌呤。

圖2 洪連樣品psbA-trnHN-J樹

4 討論

準確的基原鑒定是保障藥材質量的根本，因各種原因，民族藥材基礎研究薄弱，基礎工作不足，質量控制及監管整體水平較低，存在的主要問題是實際使用的藥材與標準不相符，標準執行上存在一定問題[9-10]，目前洪連藥材的臨床用藥與現有標準存在很大差距，市售藥材的來源較多，藥材在流通中以同屬多種植物作為替代品的現象很常見[11]。因此對洪連藥材進行準確鑒別具有非常重要的意義。

本研究采用ITS及psbA-trnH序列對12批兔耳草屬的藥材進行鑒別，結果顯示，12批的兔耳草來源于3個種，分別是短管兔耳草、全緣兔耳草與紫葉兔耳草。根據遺傳距離構建N-J樹3種兔耳草明顯聚為3支，表明DNA條形碼能準確區分兔耳草屬的各個種，并且鑒定結果與形態鑒別結果相吻合。但鑒于本研究所選取樣本有限，想要實現快速精準鑒別，還需要對更多樣本的DNA進行擴增，以便積累更多的數據。

本研究以藏藥洪連的精準鑒別為切入點，解決了洪連藥材受樣品形態、植物生長期、有花無花以及人為主觀因素等限制的問題[12]，為藏藥的準確鑒別提供了可靠的方法，為藏藥資源進一步的開發與利用奠定基礎，同時為藏藥的質量與臨床安全用藥提供了參考。