蘇龍嘎-4顆粒抗炎 鎮(zhèn)痛 止瀉的藥效學實驗研究△

陳影，蘇萍，張廣平，張海靜，楊依霏，陳騰飛，馬麗娜， 侯紅平，高云航，李晗，張鐘秀，葉祖光*

1.遼寧師范大學 生命科學學院，遼寧 大連 116000；2.中國中醫(yī)科學院 中藥研究所，北京 100075

腹瀉可導致人和動物腸道正常菌群失調(diào)、吸收障礙、營養(yǎng)狀態(tài)和免疫功能降低，是引起兒童患病和死亡的第二大病因[1]。蒙醫(yī)藥是我國少數(shù)民族醫(yī)藥之一，是內(nèi)蒙古自治區(qū)區(qū)醫(yī)療事業(yè)的特色與優(yōu)勢[2]。蒙醫(yī)將小兒腹瀉分為寒熱兩型病，熱瀉是由于熱、銳性外因致小兒三根失調(diào)，齊蘇和希拉之熱偏盛下注腸腑而引起[3]。蒙藥蘇龍嘎-4湯為臨床治療小兒熱瀉的常用驗方，出于《蒙醫(yī)傳統(tǒng)驗方》，引自《內(nèi)蒙古蒙成藥標準》[4-5]。蘇龍嘎-4顆粒是從蘇龍嘎-4湯的基礎(chǔ)上發(fā)展出的1種新劑型，與湯劑相比，顆粒劑體積小，易攜帶、儲藏及運輸，不易變質(zhì)且口感好，患者依從性高，比湯劑更受醫(yī)患歡迎。蘇龍嘎-4顆粒由連翹、拳參、木通和麥冬4味藥配伍組成，性涼，具有清熱燥濕之功效，主治大小腸之熱、腸刺痛、痢疾、熱瀉等[6]。該方中連翹為主藥，用于腑熱、腸刺熱、熱瀉[7]；配合麥冬清熱-抑希拉的效果；木通清腑中之熱；拳參解毒、止瀉，對大小腸等腑器熱癥有特效[8]。本研究通過評價蘇龍嘎-4顆粒澀腸、止瀉、抗炎和鎮(zhèn)痛等方面的作用，以期為臨床合理用藥提供實驗支持。

1 材料

1.1 動物

SPF級ICR小鼠(16～18 g)和SPF級昆明種小鼠(16～18 g)，雌雄各半，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中藥研究所SPF動物房，屏障系統(tǒng)，人工光照，12 h明暗周期，溫度控制在20～26 ℃，相對濕度控制在40%～70%，換氣次數(shù)不少于15次/h。適應環(huán)境3 d后開始實驗。

1.2 試藥

蘇龍嘎-4顆粒(內(nèi)蒙古奧特奇蒙藥股份有限公司，批號：190411，純度：2.454 g·g-1)；活性炭(天津市恒興化學試劑制造有限公司，批號：20190103)；阿拉伯膠(天津市致遠化學試劑有限公司，批號：2019040191)；蓖麻油(河南省華龍藥業(yè)有限公司，批號：20181103)；硫酸鎂(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20190220)；番瀉葉(北京同仁堂藥店，批號：180104002)；二甲苯(北京化工廠，批號：20171016)；冰乙酸(上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10107172)；洛哌丁胺(西安楊森制藥有限公司，批號：181018267)；腸炎寧片(江西康恩貝中藥有限公司，批號：1809011)；阿司匹林泡騰片(阿斯利康制藥有限公司，批號：1806211)；0.9%氯化鈉溶液(山東華魯制藥有限公司，批號：13116040408)。

1.3 儀器

ME204E型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；102中速定性濾紙；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；串籠；直徑7 mm打孔器；HW.SY21-KP4型智能恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表公司)。

2 方法

2.1 小腸推進實驗

2.1.1正常小鼠小腸推進實驗 取ICR小鼠60只，隨機分為6組：空白組、陽性組(洛哌丁胺)、蘇龍嘎-4顆粒各劑量組(0.16、0.33、0.65、1.30 g·kg-1)，每組10只，雌雄各半。空白組灌胃給予去離子水，陽性組灌胃給予洛哌丁胺(0.002 g·kg-1)，蘇龍嘎-4顆粒各受試藥組分別灌胃給予相應濃度受試藥液。各組動物灌胃容積均為20 mL·kg-1，連續(xù)給藥3 d。末次給藥前禁食不禁水24 h，末次給藥30 min后，各組動物每只給予5%炭末混懸液(用10%阿拉伯膠溶液配制)0.2 mL。20 min后脫頸處死，打開腹腔分離腸系膜，剪取從幽門至回盲腸的腸管，置于鋪有0.9%氯化鈉溶液的托盤上，將小腸不加牽引輕輕擺成直線，測量幽門到回盲腸的長度，作為小腸全長，再測量幽門至炭末前沿長度記錄為炭末推進距離，并計算炭末推進率[9-10]。

炭末推進率=炭末推進距離/小腸全長×100%

(1)

2.1.2蓖麻油所致腹瀉小鼠小腸推進實驗 取ICR小鼠70只，隨機分為7組：空白組、模型組、陽性組(洛哌丁胺)、蘇龍嘎-4顆粒各劑量組(0.16、0.33、0.65、1.30 g·kg-1)，每組10只，雌雄各半，空白組和模型組灌胃給予去離子水，陽性組灌胃給予洛哌丁胺(0.002 g·kg-1)，蘇龍嘎-4顆粒各受試藥組分別灌胃給予相應濃度受試藥液。各組動物灌胃容積均為20 mL·kg-1，連續(xù)給藥3 d。末次給藥前禁食不禁水24 h，末次給藥20 min后，除空白組外，其余各組動物每只給予蓖麻油0.3 mL，30 min后各組動物每只給予5%炭末(用10%阿拉伯膠溶液配制)混懸液0.2 mL[11]。動物處理同2.1.1。

2.2 止瀉實驗

2.2.1蓖麻油致小鼠腹瀉的止瀉實驗 取ICR小鼠70只，隨機分為7組，每組10只，雌雄各半。動物分組、給藥劑量同2.1.2，連續(xù)給藥3 d。末次給藥前12 h各組動物禁食不禁水，末次給藥后30 min，除空白組外，其余各組動物每只灌胃給予蓖麻油原液0.3 mL[12]。

2.2.2硫酸鎂致小鼠腹瀉的止瀉實驗 除造模劑為15%的硫酸鎂，每只動物灌胃容積為0.4 mL外，其余操作同2.2.1。

2.2.3番瀉葉致小鼠腹瀉的止瀉實驗 除造模劑為20%的番瀉葉，每只動物灌胃容積為0.5 mL外，其余操作同2.2.1。

2.2.4療效評價標準 造模后小鼠單籠飼養(yǎng)，籠底放置濾紙供收集糞便和計數(shù)使用，1 h更換濾紙1次。觀察小鼠腹瀉潛伏期及6 h內(nèi)小鼠的累積稀便數(shù)，并統(tǒng)計計算稀便抑制率[13]。

稀便抑制率=(模型組平均稀便數(shù)-給藥組 平均稀便數(shù))/模型組平均稀便數(shù)×100%

(2)

小鼠大便分為5種：正常便；外型正常但含水分多的軟便；外型不正常的軟便；水樣便；黏液便。將前2種視為正常便，后3種視為腹瀉便[14]。

2.3 抗炎鎮(zhèn)痛實驗

2.3.1抗炎實驗 取ICR小鼠70只，隨機分為7組，每組10只，雌雄各半。除陽性組為阿司匹林(0.26 g·kg-1)外，動物分組、給藥劑量同2.1.2，連續(xù)給藥3 d。末次給藥30 min后，空白組小鼠用移液槍在右耳兩面涂20 μL 0.9%氯化鈉溶液，其余各組小鼠右耳涂以20 μL 100%二甲苯致炎，左耳不做處理。30 min后將小鼠脫頸處死，用直徑7 mm規(guī)格的打孔器在左右兩耳相同部位打下耳片，于電子天平上分別稱取兩耳片的濕質(zhì)量，以兩耳質(zhì)量之差作為炎癥腫脹度觀察指標，并計算耳腫脹率和抑制率[15-16]。

耳腫脹率=(右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量)/ 左耳質(zhì)量×100%

(3)

抑制率=(模型對照組平均腫脹度-給藥組平均 腫脹度)/模型對照組平均腫脹度×100%

(4)

2.3.2鎮(zhèn)痛實驗 取昆明種小鼠70只，隨機分為7組，每組10只，雌雄各半。除陽性組為腸炎寧(0.90 g·kg-1)外，動物分組、給藥劑量同2.1.2，連續(xù)給藥3 d。于末次給藥1 h后，空白組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液10 mL·kg-1，其余各組小鼠腹腔注射1%冰醋酸溶液10 mL·kg-1，注射后，立即放入透明觀察箱中，觀察并記錄小鼠扭體潛伏期和20 min內(nèi)小鼠的扭體次數(shù)。取各給藥組的扭體次數(shù)與模型組平均扭體次數(shù)比較，進行統(tǒng)計學檢驗，同時計算扭體反應抑制率。觀察標準：腹腔內(nèi)凹，伸展后肢，臀部抬高[17-18]。

扭體抑制率=(模型組平均扭體次數(shù)-給藥組平均 扭體次數(shù))/模型組平均扭體次數(shù)×100%

(5)

2.4 統(tǒng)計學方法

3 實驗結(jié)果

3.1 對小鼠小腸推進的影響

3.1.1對正常小鼠小腸推進的實驗結(jié)果 與空白組相比，蘇龍嘎-4顆粒0.33、1.30 g·kg-1劑量組對小腸推進均具有抑制作用(P<0.05，P<0.01)，洛哌丁胺組對小腸推進具有顯著抑制作用(P<0.01)，各組小鼠的炭末推進距離和炭末推進率的詳細實驗數(shù)據(jù)見表1。

表1 蘇龍嘎-4顆粒對正常小鼠腸推進 運動的影響

注：空白組比較*P<0.05，**P<0.01； —表示該項無內(nèi)容。

3.1.2對蓖麻油致腹瀉小鼠小腸推進的實驗結(jié)果 與空白組相比，模型組炭末推進距離與推進率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，說明蓖麻油對小腸蠕動有促進作用。與模型組相比，蘇龍嘎-4顆粒除最低劑量組外其余各組對小腸推進均具有抑制作用(P<0.01，P<0.001)，洛哌丁胺組對小腸推進具有顯著抑制作用(P<0.001)，各組小鼠的炭末推進距離和炭末推進率的詳細實驗數(shù)據(jù)見表2。

表2 蘇龍嘎-4顆粒對蓖麻油致腹瀉小鼠腸 推進運動的影響

注：空白組比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組比較：△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001； —代表該項無內(nèi)容，下同。

3.2 對藥物性腹瀉影響

3.2.1對蓖麻油致小鼠腹瀉的影響 與空白組相比，模型組稀便數(shù)顯著增加(P<0.001)，證明造模成功。與模型組相比，蘇龍嘎-4顆粒0.65、1.30 g·kg-1劑量組初次腹瀉時間明顯延遲(P<0.01，P<0.001)；洛哌丁胺組稀便數(shù)顯著降低(P<0.05)，蘇龍嘎-4顆粒各劑量組稀便數(shù)均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，表明蘇龍嘎-4顆粒對蓖麻油誘導的腹瀉有抑制作用。各組小鼠的稀便數(shù)和稀便抑制率的詳細實驗數(shù)據(jù)見表3。

表3 蘇龍嘎-4顆粒對蓖麻油致小鼠 腹瀉的影響

3.2.2對硫酸鎂致小鼠腹瀉的影響 與空白組相比，模型組稀便數(shù)顯著增加(P<0.001)，證明造模成功。與模型組相比，蘇龍嘎-4顆粒1.30 g·kg-1劑量組與洛哌丁胺組初次腹瀉時間明顯延遲(P<0.05)；與模型組相比，各給藥組對硫酸鎂誘導的腹瀉也有抑制作用，但稀便數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；表明蘇龍嘎-4顆粒對硫酸鎂誘導的腹瀉無明顯抑制作用。各組小鼠的稀便數(shù)和稀便抑制率的詳細實驗數(shù)據(jù)見表4。

表4 蘇龍嘎-4顆粒對硫酸鎂致小鼠腹瀉的影響

3.2.3對番瀉葉致小鼠腹瀉的影響 與空白組相比，模型組稀便數(shù)顯著增加(P<0.001)，證明造模成功。與模型組相比，洛哌丁胺組與蘇龍嘎-4顆粒0.33、0.65、1.30 g·kg-1劑量組初次腹瀉時間明顯延遲(P<0.05，P<0.01，P<0.001)；與模型組相比，洛哌丁胺組及蘇龍嘎-4顆粒0.33、0.65、1.30 g·kg-1劑量組稀便數(shù)均顯著降低(P<0.01)，表明蘇龍嘎-4顆粒對番瀉葉誘導的腹瀉有抑制作用。各組小鼠的稀便數(shù)和稀便抑制率的詳細實驗數(shù)據(jù)見表5。

表 5 蘇龍嘎-4顆粒對番瀉葉致小鼠腹瀉的影響

3.3 抗炎鎮(zhèn)痛作用

3.3.1對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 與空白組相比，模型組小鼠耳腫脹率顯著提高(P<0.001)，證明模型成立。與模型組相比，蘇龍嘎-4顆粒0.65、1.30 g·kg-1劑量組和阿司匹林組均能顯著抑制二甲苯所致的耳腫脹(P<0.01，P<0.001)，抗炎作用顯著；蘇龍嘎-4顆粒0.16、0.33 g·kg-1劑量組對二甲苯所致耳廓腫脹也有抑制作用，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗結(jié)果表明，蘇龍嘎-4顆粒對小鼠耳腫脹炎癥模型有消腫抗炎作用。各組小鼠的腫脹率和腫脹抑制率的詳細實驗數(shù)據(jù)見表6。

表6 蘇龍嘎-4顆粒對二甲苯所致小鼠 耳廓腫脹的影響

3.3.2對醋酸所致小鼠扭體次數(shù)的影響 與空白組相比，模型組小鼠扭體次數(shù)顯著提高(P<0.001)，證明模型成立。與模型組相比，蘇龍嘎-4顆粒各劑量組和腸炎寧片組均能極顯著抑制醋酸引起的小鼠疼痛反應，減少小鼠扭體次數(shù)(P<0.05，P<0.01，P<0.001)；均不能延遲初次疼痛時間(P>0.05)；各組小鼠的扭體次數(shù)和扭體抑制率的詳細實驗數(shù)據(jù)見表7。

表7 蘇龍嘎-4顆粒對醋酸致小鼠扭體的影響

4 討論

蘇龍嘎-4湯是止瀉作用顯著的蒙醫(yī)湯劑，其方中連翹、拳參、木通、麥冬均有抗炎、抗菌作用，連翹解熱止吐，拳參止瀉，木通利尿鎮(zhèn)痛效果顯著[5，19-20]。臨床上常用蘇龍嘎-4湯治療嬰幼兒腹瀉病，并且在長期臨床使用中已證明療效確切[21-22]。已有實驗研究表明蘇龍嘎-4湯劑和顆粒劑對小鼠小腸推進運動均有抑制作用[23]；蘇龍嘎-4湯劑能抑制腸道致病菌，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，能促進杯狀細胞的分化和生長，增強其分泌黏液功能，提高腸黏膜保護屏障作用[24-25]。但其藥效作用研究不夠全面，因此本實驗從藥效角度出發(fā)，研究蘇龍嘎-4顆粒的澀腸、止瀉、抗炎、鎮(zhèn)痛作用。

在小腸推進實驗中，炭末在小腸的推進率間接反映了小腸的運動，其結(jié)果顯示蘇龍嘎-4顆粒對正常小鼠的腸推進和蓖麻油腹瀉模型小鼠的腸推進均有明顯的抑制作用，其作用與洛哌丁胺較接近，說明蘇龍嘎-4顆粒對小腸蠕動和蓖麻油刺激所致的小腸蠕動紊亂均有抑制作用。該實驗結(jié)果與參考文獻[23]研究結(jié)果一致，說明蘇龍嘎-4顆粒能夠抑制腸蠕動。

在止瀉實驗中，通過建立蓖麻油致滲出性腹瀉模型、硫酸鎂致滲透性腹瀉模型和番瀉葉致分泌性腹瀉模型3種常用的動物藥物性腹瀉模型，來探討蘇龍嘎-4顆粒的抗腹瀉作用[26]。結(jié)果顯示蘇龍嘎-4顆粒對蓖麻油所致腹瀉的止瀉效果顯著且能夠顯著延遲腹瀉發(fā)生，且其止瀉作用強于洛哌丁胺；蘇龍嘎-4顆粒對番瀉葉所致腹瀉的止瀉效明顯同樣能夠顯著延遲腹瀉發(fā)生，但其對腹瀉的抑制作用低于洛哌丁胺；蘇龍嘎-4顆粒對硫酸鎂所致腹瀉的止瀉效果最不明顯，但能夠顯著延遲腹瀉發(fā)生。表明蘇龍嘎-4顆粒對蓖麻油所致腹瀉的止瀉效果最強，對番瀉葉所致腹瀉的止瀉效果次之，對硫酸鎂所致腹瀉的止瀉效果最不明顯。3種腹瀉模型致瀉原理和部位均不同，蓖麻油與番瀉葉均為刺激性瀉藥。蓖麻油系刺激小腸性瀉藥，在胃腸道內(nèi)釋放蓖麻油酸，刺激腸黏膜損害黏膜細胞，引起炎癥而導致滲出性腹瀉，且蓖麻油及其有效成分會抑制腸道對水和電解質(zhì)的吸收，從而起到潤腸通便的作用[27]。番瀉葉系刺激大腸性瀉藥，其致瀉機制主要是番瀉葉中的番瀉苷A、番瀉苷B經(jīng)胃和小腸吸收后，在肝中分解，分解產(chǎn)物進入血液，經(jīng)血液循環(huán)引起骨盆神經(jīng)節(jié)興奮，從而收縮大腸、刺激結(jié)腸，增強腸蠕動而促進糞便排出[28-29]。硫酸鎂為容積性瀉藥，其使腸容積增大刺激腸壁而導致滲透性腹瀉。硫酸鎂在腸管內(nèi)吸收水分后膨脹，通過增加大便量，擴張腸道容積，刺激腸蠕動，從而增強導瀉效果[30-31]。本實驗結(jié)果表明，蘇龍嘎-4顆粒對小腸和大腸不同部位引起的腹瀉均能發(fā)揮作用，且對刺激性瀉藥蓖麻油和番瀉葉所致腹瀉的止瀉效果強于容積性瀉藥硫酸鎂。

在抗炎鎮(zhèn)痛實驗中，分別采用二甲苯所致小鼠耳廓腫脹法研究蘇龍嘎-4顆粒的消炎作用，小鼠醋酸扭體法研究蘇龍嘎-4顆粒的鎮(zhèn)痛作用。在二甲苯致小鼠耳腫脹實驗中，二甲苯涂在小鼠耳廓上面，導致毛細血管通透性增大，組織液滲透增多，產(chǎn)生紅腫現(xiàn)象[15]。通過測量小鼠耳朵質(zhì)量計算腫脹率和腫脹抑制率，反映蘇龍嘎-4顆粒對急性炎癥抑制效果。實驗結(jié)果顯示蘇龍嘎-4顆粒能顯著降低腫脹率、提高腫脹抑制率，其作用強于阿司匹林，表明蘇龍嘎-4顆粒對小鼠二甲苯所致的耳腫脹具有明顯的消炎作用。在醋酸所致小鼠扭體反應實驗中，蘇龍嘎-4顆粒4個劑量組均能明顯減少小鼠扭體反應的次數(shù)、提高扭體抑制率，其作用強于腸炎寧片，表明蘇龍嘎-4顆粒對小鼠腹腔注射醋酸引起急性腹膜炎而產(chǎn)生的疼痛有明顯的鎮(zhèn)痛效果。

綜上所述，本研究證明了蘇龍嘎-4顆粒具有澀腸、止瀉、抗炎及鎮(zhèn)痛作用，具有良好的開發(fā)和應用前景。其結(jié)果為蘇龍嘎-4顆粒的臨床應用提供了實驗參考，作用機制方面還有待進一步研究。