美花石斛和鐵皮石斛試管苗物質含量比較△

曾宇馨，張悅，祝天添，賀雨馨，孫志蓉

北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488

石斛作為名貴中藥材，具有養胃生津、滋陰清熱、明目等功效[1]。現代研究表明，石斛含多種有效成分，其中多糖具有增強免疫功能和抗腫瘤作用[2]，且石斛生理活性強弱與其多糖含量呈正相關[3-4]。質量評價中常以多糖含量高低判斷某一石斛類藥材質量的好壞[5]。近年來由于價格高昂和需求量大致使野生石斛采挖過度，石斛已被列為中國三級珍稀瀕危保護植物，但人工栽培石斛成活率一直不高，致使石斛類藥材需求缺口越來越大。在種苗培育方面，以鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo等的研究報道居多，鮮有美花石斛DendrobiumloddigesiiRolfe相關報道[6-7]。為保護并綜合開發利用野生石斛資源，本研究對美花與鐵皮石斛試管苗生長發育情況及物質組分含量變化進行對比，目的是揭示其有效成分動態累積隨生長情況的變化規律，借鑒鐵皮石斛種苗培養研究，為石斛培養提供參數支持。

1 材料

糖類測定儀器：Waters 244高效液相色譜儀、氨基酸測定儀器：Waters alliance w2695高效液相色譜儀；內源激素測定儀器：Agilent 1100高效液相色譜儀；旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器有限公司)。

多糖(以葡聚糖計，相對分子量104)、棉籽糖、麥芽糖、葡萄糖和果糖對照品(北京生物試劑公司，純度≥99.0%)；天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及色氨酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，純度≥99.0%)；赤霉素(GA3)、生長素(IAA)、脫落酸(ABA)和玉米素(ZR)對照品(世紀華林公司，純度≥97.0)；乙腈、甲醇為色譜純(美國Waters公司)；糖類和內源激素測定使用高純水；氨基酸測定使用去離子水；其他試劑均為分析純。

美花石斛及鐵皮石斛種子(貴州吉仁堂藥業公司)經北京中醫藥大學中藥資源系孫志蓉教授鑒定為蘭科植物美花石斛D.loddigesiiRolfe及鐵皮石斛D.officinaleKimura et Migo的種子。無菌種子萌發培養基材料：MS培養基+萘乙酸(NAA) 0.2 mg·L-1+2%白砂糖+15%馬鈴薯提取液+瓊脂粉，生根壯苗培養基材料：MS培養基+NAA 0.5 mg·L-1+3%白砂糖+20%馬鈴薯提取液+1%活性炭+瓊脂粉。

2 方法

2.1 試管苗生長調查

消毒后在無菌種子萌發培養基中生長2個月，選長勢大小一致的幼苗，轉接到生根壯苗培養基上，接種密度為10 株/瓶。培養條件為光照強度27 μmol·m-2·s-1，光照時間12 h·d-1，溫度(25±2)℃，最后選取生長6～10個月的美花及鐵皮石斛試管苗作試驗材料，一部分于60 ℃烘干至恒重，用于生長量、生物量、多糖及氨基酸含量測定，另一部分存于-20 ℃冰箱中用于內源激素含量測定。成苗后，對美花和鐵皮石斛試管苗取樣，各時期隨機抽取5瓶，從中隨機取30株，測定其單株生長量及生物量。

2.2 糖類測定

供試品溶液制備：準確稱取0.3～0.5 g樣品，加水定容至50 mL，高壓鍋煮沸1 h，放至室溫，將濾液離心后取上清液并通過0.45 μm微孔濾膜后，取續濾液備用。

色譜條件：Waters Sugar-pak-1色譜柱(300 mm×6.5 mm，10.0 μm)；流動相為水；柱溫：70 ℃；檢測器：RI4×；流速：0.6 mL·min-1。

在上述色譜條件下，分別取對照品溶液和樣品溶液各20 μL進樣，外標法進行定量。HPLC圖見圖1。

(1)

C：100 g樣品中各類糖質量(g)；C1：對照品進樣體積中各糖質量(μg)；C2：樣品稱樣量(g)；V1：對照品體積(μL)；V2：樣品定容體積(mL)；A1：對照品中各組分峰面積平均值；A2：樣品中各相應峰面積平均值。

2.3 氨基酸含量測定

供試品溶液制備：準確稱取經烘干粉碎后的樣品0.05 g于安瓿瓶中，加入10 mL 6 mol·L-1HCl，抽真空后封口，于110 ℃烘箱中水解24 h后，取出冷卻，用25 mL容量瓶定容，樣品液經定量濾紙過濾后取10 mL濾液，水浴蒸干，用5 mL去離子水洗出，過0.45 μm微孔濾膜后備用。

注：A.葡聚糖對照品；B.葡萄糖、果糖、二糖、三糖對照品；C.葡聚糖樣品；D.葡萄糖、果糖、二糖、三糖樣品。圖1 糖類對照品及樣品HPLC圖

色譜條件：Waters AccQ·Tag 氨基酸分析色譜柱(15 mm×3.9 mm，4.6 μm)；以0.14 mol·L-1NaAc溶液(含0.017 mol·L-1三乙胺，pH=4.95)為流動相A，以60%乙腈水溶液為流動相B；梯度洗脫(0～0.5 min，100%～98%A；0.5～15 min，98%～93%A；15～19 min，93%～90%A；19～32 min，90%～67%A；32～33 min，67%A；33～34 min，67%～0%A；34～37 min，0%A；37～38 min，0%～100%A)；柱溫：37 ℃；檢測波長(熒光檢測器)Ex：250 nm，Em：395 mm；流速：1.0 mL·min-1。

EPCU氣路板內部包含總風風道、列車管風道、均衡風道、16#管風道、20#管風道、13#管風道和制動缸風道，EPCU氣路板出現故障時，總風向列車管串風導致列車管壓力上漲。

在上述色譜條件下，取溶液10 μL，用AccQ·Fluor試劑衍生，外標法定量氨基酸含量。

2.4 內源激素含量測定

供試品溶液的制備：稱取待測樣品1.0 g，加少量二乙基二硫代氨基甲酸鈉，用80% 甲醇研磨至勻漿，冰甲醇清洗，將研磨好的材料移至小燒杯中，用錫紙覆蓋燒杯口放入冰箱保存一夜；將燒杯中樣品溶液抽濾后，濾液轉移至濃縮瓶，滴加1～2滴氨水，于旋轉蒸發儀上36 ℃濃縮至水相；濃縮完畢后將水溶液轉移至10 mL試管，體積不超過5 mL；試管放入冰箱中凍融交替3次；解凍后樣品離心25 min后將上清液吸至燒杯，用2 mol·L-1HCl或NaOH調整pH，將待測GA3、IAA、ABA樣品調整到pH為2.5～3.0，將待測ZR樣品調整到pH為7.5～8.0，將燒杯中樣品溶液移至試管；待測GA3、IAA、ABA樣品用等體積乙酸乙酯萃取3次，每次用滴管轉移上清液到濃縮瓶中合并有機相，滴加1～2滴氨水；將待測ZR樣品用pH為8.0的磷酸緩沖液及飽和正丁醇萃取3次，將上清液轉移到濃縮瓶中合并有機相。用旋轉蒸發儀濃縮樣品溶液至固態；濃縮后樣品用流動相溶解定容至1 mL青霉素管中待測。

色譜條件：Agilent 1100 series色譜柱(250 mm×4.0 mm，5.0 μm)；以甲醇為流動相A，以0.1 mol·L-1HAc(測GA3、IAA、ABA)及H2O(測ZR)為流動相B；梯度洗脫(0～15 min，3%～40%A；15～35 min，40%A；35～40 min，40%～3%A)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：254、280、320 nm。

在上述色譜條件下，用外標法定量測定內源激素。

3 結果

3.1 試管苗生長情況分析

由圖2～5可知，美花石斛和鐵皮石斛試管苗各生長指標變化趨勢基本一致，僅各項指標測定值及動態變化高峰期有差異。兩者苗高均呈增長趨勢；鐵皮石斛莖粗增長略快，兩者總趨勢一致；鐵皮石斛根長與生長時間呈正相關，而美花石斛根長呈快-慢-快的增長趨勢；除6個月外，鐵皮石斛分蘗數稍高于美花石斛。整體特征為鐵皮石斛苗高、莖粗及分蘗數基本高于美花石斛，根長低于美花石斛，說明鐵皮石斛苗期生長較好，形態較美花石斛更粗壯，美花石斛整體更纖弱。

注：各月分析n=30；2種石斛種間分析n=240。下同。圖2 石斛試管苗苗高變化圖

圖3 石斛試管苗莖粗變化圖

圖4 石斛試管苗根長變化圖

圖5 石斛試管苗分蘗數變化圖

就生物量動態累積而言，美花和鐵皮石斛苗生物量動態積累總趨勢基本一致(見圖6～7)。在生長發育過程中，鮮質量變化表現為鐵皮石斛動態積累較緩，而美花石斛動態積累量較迅速；兩者干質量積累趨勢一致，美花石斛7～8個月積累較快。美花石斛鮮質量及干質量在各時期均低于鐵皮石斛，說明鐵皮石斛在整個生長過程中長勢優于美花石斛。

圖6 石斛試管苗鮮質量變化圖

圖7 石斛試管苗干質量變化圖

3.2 水溶性多糖和單糖含量變化及組分分析

由表1能看出，2種石斛試管苗總糖中多糖比例均較大。其中，美花石斛多糖含量高，而鐵皮石斛單糖及二糖含量較美花石斛高。美花石斛苗多糖和總糖含量先升后降，7個月達峰值，并且此時能同時檢測到二糖、葡萄糖及果糖，且多糖占總糖百分比大，說明此時正是美花石斛生長和生物量積累的黃金時期。鐵皮石斛3個時期也能同時檢測到二糖、葡萄糖及果糖，10個月時還能檢測到三糖，說明鐵皮石斛在生長期間代謝活動較旺；除果糖外各糖類均在6個月時含量最高，而后逐漸降低，說明在此過程中鐵皮石斛消耗量略大于積累量，各糖類多用于苗期營養生長，也側面印證了鐵皮石斛長勢較美花石斛更強。

3.3 氨基酸含量變化及組分分析

隨生長時間增加，兩者試管苗中氨基酸總量均呈降低趨勢。前3個時期美花石斛氨基酸總量高于鐵皮石斛，10個月時鐵皮石斛略高于美花石斛(見圖8)。植物氨基酸種類、含量及組成比是評價營養價值的重要指標，因此比較了兩者8種必需氨基酸(色氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸)之和。兩者必需氨基酸之和與半必需氨基酸之和變化不明顯，美花石斛必需氨基酸峰值在8個月，鐵皮石斛苗呈緩降趨勢；鐵皮石斛半必需氨基酸峰值在7個月，美花石斛呈降-平-降的緩降趨勢(見圖9～10)。兩者非必需氨基酸之和的變化趨勢同總氨基酸(見圖11)。總體來說美花石斛氨基酸量高于鐵皮石斛，營養價值會更高。

天冬氨酸和谷氨酸能降低植物體內無機氮含量，主要作用是植物將氮從源向庫轉移，同時在氮源充足條件下儲存氮，以備植物體生長、防御和繁殖之需。兩者之和均隨生長時間增加而減少(見圖12)，10個月時鐵皮石斛含量略高于美花石斛。支鏈氨基酸(異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸)屬8種必須氨基酸，在營養學中也占重要地位，同時也是植物次生代謝不可或缺的前體物質。如圖13所示，美花石斛、鐵皮石斛支鏈氨基酸含量峰值分別在8個月和7個月，而在10個月時差異不明顯，美花石斛、鐵皮石斛10個月支鏈氨基酸占必需氨基酸比例為53.7%和57.2%。

圖8 石斛試管苗氨基酸總量變化圖

圖9 石斛試管苗必需氨基酸含量變化圖

圖10 石斛試管苗半必需氨基酸含量變化圖

表1 石斛試管苗生長發育過程中糖類成分質量分數

注：—表示未發現。

圖11 石斛試管苗非必需氨基酸含量變化圖

圖12 石斛試管苗天冬氨酸及谷氨酸之和含量變化圖

圖13 石斛試管苗支鏈氨基酸含量變化圖

脯氨酸與植物抗逆性有關，一般來說植物內脯氨酸含量很低；但遭遇干旱、低溫、鹽堿等脅迫時，脯氨酸含量便會驟增[8-9]。同時，脯氨酸代謝是耐脅迫代謝工程中的靶向標，利用遺傳工程可改造脯氨酸的合成及分解，以便增強植物抗逆性。2種石斛苗中鐵皮石斛脯氨酸波動大，峰值在8個月，美花石斛脯氨酸含量波動小，總體低于鐵皮石斛。說明鐵皮石斛在生長中較美花石斛的抗逆性略有優勢。

圖14 石斛試管苗脯氨酸含量變化圖

3.4 內源激素含量變化及組分分析

3.4.1試管苗內源激素含量變化比較 對2種石斛試管苗6、8、10月內源激素含量進行統計分析。其中，GA3及ZR含量差異最為顯著。GA3能促進植物莖葉生長，加速細胞伸長生長。由圖15可知，美花石斛呈緩降趨勢，而鐵皮石斛則為上升趨勢，且含量數倍高于美花石斛，佐證了該生長時間內鐵皮石斛苗高及莖粗高于美花石斛的現象。ZR可促進植物細胞分裂，阻止葉綠素和蛋白質降解而使呼吸作用減弱。由圖16可知，美花石斛ZR含量雖呈緩降趨勢，但顯著高于鐵皮石斛，生長量上體現為美花石斛根長大于鐵皮石斛，由于呼吸作用消耗減少，多糖及蛋白質含量也高于鐵皮石斛。

圖15 石斛試管苗GA3含量變化圖

圖16 石斛試管苗ZR含量變化圖

兩者IAA及ABA含量變化趨勢基本一致，3個時期含量均為美花石斛略高于鐵皮石斛。IAA對植物頂部芽端形成有促進作用，與植物生長密切相關。如圖17、18，鐵皮石斛較美花石斛含量較低，而IAA低濃度時有促進生長作用，較高濃度則會抑制生長，一定程度上說明了鐵皮石斛生物量及生長量略高于美花石斛的生理現象。ABA可抑制整株植物生長，與GA3、ZR及IAA作用相反，對細胞的分裂與伸長有抑制作用。美花石斛ABA含量明顯高于鐵皮石斛，表明美花石斛苗期生長可能受到了ABA調控，導致生物量及生長量不及鐵皮石斛。

圖17 石斛試管苗IAA含量變化圖

圖18 石斛試管苗ABA含量變化圖

3.4.2美花石斛激素含量與生物量相關性分析 對美花石斛試管苗6、7、8、10月內源激素含量進行分析。GA3含量呈遞減趨勢，6～8個月時GA3含量較高，相對應的6～8個月苗高、根長及干物質積累速率較快；但在10個月時，GA3含量驟降后干質量積累速率也減緩。ABA含量不斷升降，8個月時苗高及干質量積累速率達最高，而此時ABA含量最低；在8～10個月時ABA含量增高，對應的苗高、根長及干質量積累速率降低。在8個月時GA3/ABA比值高，此時正是試管苗生長發育最旺盛時期，除根長外各積累速率也達峰值。8個月后的GA3/ABA比值下降，可能是試管苗后期生長緩慢的原因之一。

IAA含量先升后降，8個月時IAA含量達到峰值，此時試管苗生長快，分蘗少；IAA含量與分蘗數總體呈負相關。ZR含量不斷升降變化，前期ZR含量較高，7個月出現最低值，而后維持較高水平；6個月分蘗高峰時，ZR含量最高，而后迅速降低。6個月時試管苗分蘗數量最多，此時期IAA/ZR比值較低，7～8個月分蘗少但IAA/ZR比值卻很高，說明前期IAA/ZR比值低一定程度上促進分蘗發生。

4 結論與討論

鐵皮石斛進入生物量快速增長期較美花石斛早，且生物量快速積累持續時間長。同時，試管苗生長發育受遺傳特性和環境因素兩方面影響，美花石斛試管苗出現莖細弱、生長緩而不齊、分蘗數多等現象與其自身生長發育特性相關。

糖類為植物生長發育提供了大量物質基礎，且單糖在光合作用和呼吸作用中起著重要的作用，而多糖分子量較大，以葡聚糖計較為準確[10-12]。美花石斛試管苗多糖和總糖含量于7個月時為最，可同時測到二糖、葡萄糖及果糖，說明此時期試管苗代謝活動較為復雜。鐵皮石斛苗大部分時期能同時檢測到多種糖類，說明鐵皮石斛試管苗的代謝活動比美花石斛更加旺盛。這也是鐵皮石斛苗苗高、莖粗等生長量顯著高于美花石斛苗的生理原因。

表2 美花石斛試管苗GA3及ABA含量變化與苗高、根長及干質量積累速率關系

表3 美花石斛試管苗IAA及ZR質量分數變化與分蘗數關系

植物氨基酸種類、含量及組成是評價營養價值的重要指標，2種石斛試管苗中氨基酸總量逐漸降低，在測定4時期內，美花石斛苗氨基酸總量均高于鐵皮石斛。兩者必需氨基酸及非必需對比結果為美花石斛大部分時期高于鐵皮石斛苗，說明美花石斛部分營養價值較鐵皮石斛苗更高。

內源激素是植物體內微量信號分子，同時也是代謝反應產物，能夠調節植物生命活動周期，因此，探討內源激素變化規律與石斛試管苗生長發育間的關系尤為重要，并能借此來揭示內源激素對石斛試管苗生長調控的生理機制。兩者GA3及ZR含量差異顯著，鐵皮石斛GA3高而ZR很低，美花石斛則相反，說明2類激素在試管苗植株內可能存在拮抗作用，且GA3促進生長作用更為顯著；兩者IAA和ABA含量變化趨勢一致，美花石斛均高于鐵皮石斛，也側面證明ABA含量對試管苗生長的抑制作用。美花石斛，苗高、根長及干物質積累速率與GA3呈正相關，而與ABA含量大致呈負相關。分蘗數與IAA含量負相關，GA3/ABA比值高于美花石斛試管苗莖及根生長，IAA/ZR比值低利于根分蘗。由此可得，內源激素在規律變化的同時，也有相反情況出現，這說明試管苗生長發育過程中的生理特性既是內源激素生理功能專一性的體現，也是激素協調作用后的結果[13]。試管苗生長發育不僅需要內源激素含量達到一定水平，還需要不同內源激素間相互作用及相互平衡[14-15]。GA3含量低、ABA含量較高、GA3/ABA及IAA/ZR比值低可能是導致美花石斛試管苗長勢不如鐵皮石斛，且生長緩慢、纖弱、分蘗多的重要原因。

綜上所述，鐵皮石斛生長狀態優于美花石斛，而營養價值則為美花石斛更高，植物激素對石斛苗的影響既有專一性也有多樣性。不同種類石斛苗生長發育規律不同，導致石斛試管苗出現這些現象的詳細原因還有待深入探究。本研究揭示了石斛試管苗有效物質動態累積與生長規律的關系，為石斛的培養提供了參數支持與參考依據。