不同栽培方式 產地蒙古黃芪中黃芪甲苷和總黃酮含量差異分析△

田文倉，馮紫薇，石福娟，石玥，張靖晗，丁一明， 欒震，宋學武，趙婷，4*，魏勝利，4*

1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；2.子洲縣產業發展投資有限公司，陜西 榆林 718400；3.中華人民共和國國家衛生健康委員會 藥具管理中心，北京 102488；4.中藥材規范化生產教育部工程研究中心，北京 100102

黃芪為臨床常用的大宗藥材，來源于豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪A.membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根[1]。筆者前期調研發現目前市場流通的黃芪商品主要為蒙古黃芪，而膜莢黃芪較少，由此可見蒙古黃芪是藥用黃芪的主要來源。蒙古黃芪分布范圍極廣，根據詹志來等[2]及筆者實地調研發現蒙古黃芪現在主要分布于甘肅、內蒙、山西、陜西、寧夏等地。這些產地之間地理位置跨度大，環境迥異且各地長期以來形成了本地特有的黃芪栽培方式及產地加工技術，因此所產黃芪藥材質量參差不齊[3-5]。皂苷類(黃芪甲苷)和黃酮類成分是黃芪藥效成分的主要組成部分。研究表明黃芪甲苷具有抗炎、抑制腫瘤、保護肝損傷等作用[6-7]，黃芪中黃酮類成分具有抗氧化、抗病毒、抑制黑色素生成等作用[8]。因此研究以采自33個蒙古黃芪主產地的蒙古黃芪藥材為研究材料，以黃芪甲苷和總黃酮為評價指標，對不同栽培方式和不同產地蒙古黃芪進行差異分析，進而分析差異形成原因，以期為栽培、選購優質黃芪藥材提供理論依據。

1 材料

Waters ACQUITY-UPLC-TUV-ELS型高效液相色譜儀；AL204型電子分析天平(d=0.000 1 g，梅特勒-托利多儀器有限公司)；RE-3000型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器有限公司)；KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-1700PC紫外-可見分光光度計(上海奧析科學儀器有限公司)。

黃芪甲苷(上海融禾醫藥科技有限公司，批號141209，純度：99.45%)；毛蕊異黃酮葡萄糖苷(上海融禾醫藥科技有限公司，批號：160120，純度：99.2%)；乙腈[色譜純,CAS:75-05-8，賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；甲醇(分析純，批號：20181125，北京化工廠)；乙醇(分析純，批號：20181211，北京化工廠)；實驗室用水為超純水。

所用的樣品為課題組在2018年9—11月采集的33批蒙古黃芪藥材，經北京中醫藥大學中藥學院魏勝利教授鑒定為蒙古黃芪A.membranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao的根，憑證標本存放于北京中醫藥大學中藥資源樣品庫，樣品信息見表1。

2 方法

2.1 對照品溶液制備

黃芪甲苷對照品溶液的配制：精密稱取黃芪甲苷(105 ℃烘至恒重)對照品適量，70%甲醇定容制成質量濃度為0.75 mg·mL-1的對照品儲備溶液，備用。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液的配制：精密稱定毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(105 ℃烘至恒重)2.96 mg，用75%乙醇溶解并定容至50 mL，搖勻，即得0.059 2 mg·mL-1的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存。

表1 試驗樣品信息

2.2 供試品溶液制備

黃芪甲苷含量測定的供試品溶液制備：精密稱取藥材粉末2.0 g，置50 mL離心管中，加甲醇30 mL，超聲(功率500 W，頻率40 kHz)處理30 min，2000 r·min-1離心(離心半徑為3 cm)5 min，取上清液。殘渣再加甲醇30 mL，超聲(功率500 W，頻率40 kHz)處理30 min，2000 r·min-1離心(離心半徑為3 cm)5 min，取上清液。合并上清液，蒸干。殘渣加10%(V/V)氨水溶解并轉移至10 mL容量瓶中，定容，即得。

總黃酮含量測定的供試品溶液制備：精密稱取黃芪藥材粉末0.5 g，加25 mL 75%乙醇，超聲(功率500 W，頻率40 kHz)處理30 min，濾過，適量75%乙醇洗滌濾渣，合并濾液并定容至50 mL，從中精密量取2.0 mL溶液轉移至10 mL容量瓶中，再用75%乙醇定容，即得。

2.3 色譜條件

Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：水-乙腈(68∶3)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；氮氣流速：2 L·min-1；進樣量：20 μL。在上述色譜條件下，黃芪甲苷對照品、樣品色譜圖見圖1。

注：A.黃芪甲苷對照品；B.供試品。圖1 黃芪甲苷對照品及供試品色譜圖

2.4 總黃酮測定光譜條件

以毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為對照品，在260 nm下測定對照品及樣品吸光度值。對照品及樣品光譜圖見圖2。

注：A.對照品；B.供試品。圖2 對照品及供試品光譜圖

2.5 方法學考察

2.5.1線性關系考察 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液1、5、10、15、20、25 μL分別進樣，記錄峰面積。以黃芪甲苷的進樣濃度的對數為橫坐標X，峰面積積分值的自然對數值為縱坐標Y，繪制標準曲線，其回歸方程為Y=1.481 2X+16.045，r=0.999 4。結果表明黃芪甲苷的進樣量在0.75～18.755 μg線性關系良好。

精密量取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液1、2、4、6、8 mL置25 mL容量瓶中，75%乙醇定容。以75%乙醇作為空白，分別取適量不同濃度對照品溶液，在260 nm波長處測定吸光度。以對照品溶液濃度X為橫坐標，吸光度Y為縱坐標，繪制標準曲線，其回歸方程為Y= 56.794X+0.001 9，r=0.999 9。結果表明總黃酮進樣量在0.059 2～0.473 6 mg線性關系良好。

2.5.2精密度試驗 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液20 μL，連續進樣6次，測得峰面積，求得RSD為1.37%，表明儀器精密度良好。

取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液適量，連續測定6次，測得吸光度。求得RSD為0.09%，表明儀器精密度良好。

2.5.3重復性試驗 平行精密稱取同一樣品6份，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定含量，結果黃芪甲苷平均質量分數為1.04 mg·g-1，RSD為2.0%，說明該方法重復性良好。

平行精密稱取同一樣品6份，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，測吸光度，計算總黃酮含量，結果總黃酮質量分數平均值為4.79 mg·g-1，RSD為0.05%，表明該方法重復性良好。

2.5.4穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、8、12、24 h進樣，測得黃芪甲苷含量RSD為1.0%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

取同一供試品溶液，分別于配置后0、2、5、8、20 h測定吸光度值，測得黃酮含量RSD為1.59%，表明供試品溶液在20 h內基本穩定。

2.5.5回收率試驗 精密稱取已知黃芪甲苷質量分數(1.04 mg·g-1)的同一批樣品約2 g，共6份，精密加入黃芪甲苷對照品(0.192 mg·mL-1)各5 mL，按2.2項下方法制備供試溶液并測定，計算回收率，結果見表2。

表2 黃芪甲苷測定的加樣回收率(n=6)

精密稱取已知總黃酮質量分數(4.296 mg·g-1)的同一批樣品約0.5 g，共6份，分別置50 mL具塞錐形瓶中，再分別精密加入毛蕊異黃酮苷對照品溶液(0.059 2 mg·mL-1)25 mL，按2.2項下方法制備供試溶液，測定吸光度，計算回收率，結果見表3。

表3 總黃酮測定的加樣回收率(n=6)

2.5.6樣品測定 33批樣品分別平行取3份，按上述2種方法分別進行測定，計算含量。

2.6 數據處理

所有數據均采用Microsoft Excel software 2010及SPSS 19.0進行分析。采用單因素方差分析(ANOVA)對Duncan′s進行多因素檢驗，其中P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 不同產地、栽培方式蒙古黃芪黃芪甲苷及總黃酮含量測定結果

不同產地、栽培方式蒙古黃芪黃芪甲苷、總黃酮含量的測定結果見表4。

表4 不同產地、栽培方式蒙古黃芪中黃芪甲苷和 總黃酮質量分數 %

3.2 不同栽培方式蒙古黃芪中黃芪甲苷及總黃酮含量差異分析

蒙古黃芪有育苗移栽和種子直播2種栽培方式。全國大多數產區普遍采用育苗移栽的栽培方式，一般育苗1年后，再移栽生長1年即可采收，所產黃芪是市場主流產品。種子直播方式只在山西渾源、陜西子洲及其周邊地區采用，直播黃芪一般生長5年或5年以上才可采收。對2種栽培方式下的蒙古黃芪中黃芪甲苷和總黃酮含量分別進行分析，結果表明2種栽培方式下的黃芪甲苷含量差異有統計學意義(P<0.05)。種子直播蒙古黃芪中黃芪甲苷平均質量分數為0.245%，為育苗移栽蒙古黃芪中黃芪甲苷平均質量分數(0.151%)的1.6倍。而2種栽培方式下的總黃酮含量無統計學意義(P>0.05)，種子直播蒙古黃芪藥材總黃酮平均質量分數為0.541%，育苗移栽蒙古黃芪總黃酮平均質量分數為0.508%。

3.3 不同產地蒙古黃芪中黃芪甲苷及總黃酮含量差異分析

3.3.1不同產地育苗移栽蒙古黃芪中黃芪甲苷及總黃酮含量差異分析 通過對不同產地育苗移栽蒙古黃芪中黃芪甲苷和總黃酮含量測定及分析，結果表明，各產地育苗移栽蒙古黃芪中黃芪甲苷含量和總黃酮含量差異均有統計學意義(P<0.05)。其中黃芪甲苷質量分數最高達到0.323%，為最低值(0.061%)的5倍。總黃酮質量分數最高達到0.903%，為最低值(0.376%)的2.4倍。

3.3.2不同產地種子直播蒙古黃芪中黃芪甲苷及總黃酮含量差異分析 通過對不同產地種子直播蒙古黃芪藥材的黃芪甲苷和總黃酮含量測定及分析發現，各產地蒙古黃芪中黃芪甲苷和總黃酮含量差異有統計學意義(P<0.05)。其中黃芪甲苷含量最高的藥材來源于陜西省子洲縣西莊鄉(0.343%)，是質量分數最低的陜西省佳縣(0.161%)的2.13倍。總黃酮質量分數最高的樣品來源于陜西省府谷縣，高達0.825%，為質量分數最低的陜西省子洲縣三川口(0.399%)的2.07倍。

4 結論與討論

4.1 不同栽培方式蒙古黃芪中黃芪甲苷含量差異有統計學意義，總黃酮含量差異無統計學意義

結果表明采用種子直播所生產的蒙古黃芪中黃芪甲苷含量相對高于育苗移栽所產蒙古黃芪的，且差異有統計學意義。由樣品信息可知，種子直播黃芪生長年限一般為5年，有些甚至5年以上，而育苗移栽黃芪生長年限為2年，因此上述差異可能是由于生長年限長導致，而非僅僅是種植方式的不同導致。研究表明黃芪甲苷會隨著生長年限有先升后降的變化趨勢，降低的轉折點在5年或6年[9]，因此5年生黃芪藥材黃芪甲苷含量一般是高于2年生黃芪藥材。2種栽培方式下總黃酮含量差異無統計學意義，這與劉鳳波[10]的研究結果一致。

本研究考察的是不同栽培方式對黃芪藥材黃芪甲苷和總黃酮含量的影響，但由于受時間及空間的限制，未能保證除栽培方式以外其他因素完全一致，這也是目前這類研究[11-12]存在的普遍問題，因此對于考察栽培方式的影響還有待更加科學的試驗設計來完成。

4.2 不同產地蒙古黃芪中黃芪甲苷和總黃酮含量差異明顯

產地是道地藥材形成的原因之一，而產地對藥材的影響是與其所在地的環境因子是緊密相關的。結果表明，不論是育苗移栽種植還是種子直播種植，不同產地蒙古黃芪中黃芪甲苷和總黃酮含量差異均有統計學意義。因此在種植或選購優質黃芪藥材時要充分考慮產地因素，從結果看，選擇黃芪甲苷含量較高的黃芪應該選擇山西渾源或陜西子洲產的種子直播黃芪，選擇總黃酮含量較高的黃芪則選擇寧夏固原的育苗移栽黃芪更經濟實惠。