黃精覆盆子發(fā)酵飲品化學成分的UPLC-HRMS分析△

梅曉丹，李潔，王喻淇，宋帥，喬延江，林峰,*，張加余

1.濱州醫(yī)學院 藥學院，山東 煙臺 264003；2.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488；3.江蘇菌鑰生命科技發(fā)展有限公司，江蘇 鹽城 224100

中藥發(fā)酵炮制技術在我國已有數(shù)千年的歷史。張仲景的《金匱要略》、賈思勰的《齊民要術》以及李時珍的《本草綱目》等著名中藥典籍中都有關于中藥發(fā)酵炮制的記載和解釋[1-2]。該技術在適當?shù)臏囟群蜐穸认拢柚镛D化作用對中藥進行發(fā)酵，從而達到減毒增效、擴大藥用范圍的目的[3-4]。隨著科技的進步與發(fā)展，中藥發(fā)酵炮制技術在中藥研究領域應用更加廣泛，具有廣闊的發(fā)展前景。

黃精覆盆子發(fā)酵飲品是1種由黃精和覆盆子等中藥發(fā)酵制得的飲品。黃精和覆盆子均為我國常用中藥，具有益腎功效，亦可用于食療和保健。研究表明，黃精的主要化學成分為多糖、甾體皂苷、黃酮、蒽醌、木脂素以及生物堿等成分，具有抗衰老、抗腫瘤、抗菌、調節(jié)血糖和調節(jié)免疫等作用[5-6]；覆盆子中主要含有黃酮、萜類、甾醇以及揮發(fā)油等成分，用于治療遺尿尿頻、遺精滑精及目暗昏花等[7-8]。本研究采用超高效液相色譜-高分辨質譜法(UPLC-HRMS)技術對黃精覆盆子飲品發(fā)酵前后的化學成分進行分析，以明確發(fā)酵前后其活性成分種類的變化，為其藥用價值的進一步開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

LTQ-Orbitrap XL質譜儀[美國Thermo Fisher公司，配有電噴霧離子源(ESI)和 Xcalibur 2.1工作站]；DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司)；R200D型電子分析天平(十萬分之一，德國Sartorius公司)；Milli-Q Synthesis超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Grace PureTMSPE C18-Low固相萃取小柱[500 mg·(3 mL-1),Sigma公司]。

1.2 試藥

對照品腺苷、蘆丁、山柰酚、菝葜皂苷元和薯蕷皂苷元(成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%)；質譜級甲醇、乙腈(美國Thermo Fisher公司)；色譜級甲酸(德國Merck公司)；超純水。

黃精、覆盆子和山藥藥材均購自亳州市華云中藥飲片有限公司，均由北京中醫(yī)藥大學張媛副教授鑒定。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1混合對照品溶液的制備 分別取腺苷、蘆丁、山柰酚、菝葜皂苷元和薯蕷皂苷元5種對照品適量，精密稱定，加入甲醇配制成質量濃度約為100 μg·mL-1的儲備液，用時稀釋成濃度適宜的混合對照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備 黃精覆盆子未發(fā)酵供試品溶液的制備：分別取黃精、覆盆子和山藥粉末各10 g，精密稱定，加入300 mL純凈水，攪拌均勻后，加入適量的 NaHCO3和K2HPO4等調節(jié)pH為5.8～6.0，再加入20 g蛋白胨和80 g白砂糖，定容至1000 mL。溶液在90 ℃水浴條件下滅菌30 min。

黃精覆盆子發(fā)酵供試品溶液的制備：分別取黃精、覆盆子和山藥粉末各10 g，精密稱定，加入300 mL純凈水，攪拌均勻后，加入K2HPO4調節(jié)pH 為4.5～5.0；然后在混合液中添加1 g纖維素酶和1 g果膠酶，于50 ℃下酶解90 min；再加適量的 NaHCO3和K2HPO4等調節(jié)pH為5.8～6.0，然后加入20 g蛋白胨和80 g白砂糖，定容至1000 mL。溶液在90 ℃水浴條件下滅菌30 min，待溫度降至室溫，接種腸膜明串株菌腸膜亞種發(fā)酵(培養(yǎng)溫度為25 ℃，發(fā)酵20 d)。

供試品溶液的處理：取固相萃取小柱，先用5 mL甲醇活化，再用5 mL去離子水平衡。然后分別加入上述供試品溶液各2 mL，依次用5 mL水和5 mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，于室溫條件下用N2吹干，殘渣加入200 μL 2%乙腈溶液復溶，渦旋振蕩3 min，14 000 r·min-1(離心半徑為9.38 cm)離心15 min，吸取上清液，即得。

2.2 分析條件

2.2.1色譜條件 色譜柱：Waters HSS T3 UPLC色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～2 min，2%B；2～5 min，2%～5%B；5～35 min，5%～25%B；35～45 min，25%～40%B；45～46 min，40%～90%B)；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：2 μL。

2.2.2質譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；毛細管溫度：350 ℃；管透鏡電壓：-110 V；毛細管電壓：-35 V；噴霧電壓：3 kV；輔助氣流速：3 L·min-1；鞘氣流速：9 L·min-1；傅里葉高分辨掃描范圍m/z50～1500；一級掃描分辨率：30 000；二級質譜采用數(shù)據(jù)依賴性掃描方式進行數(shù)據(jù)獲取；激活時間：30 ms；激活能量單位：0.25 q；歸一化碰撞能量：35%。

2.3 質譜數(shù)據(jù)的預處理

利用Xcalibur 2.1工作站處理數(shù)據(jù)，通過分子式預測模塊預測母離子和子離子的分子式，相關參數(shù)設定為C[0～50]、H[0～100]、O[0～20]、N[0～5]、環(huán)不飽和雙鍵數(shù)[0～15]，質量精度誤差在1×10-5以內。

3 結果與討論

本研究采用UPLC-HRMS技術對發(fā)酵前后黃精覆盆子飲品中的化學成分變化情況進行研究。結合對照品比對、文獻報道以及液質提供的精確分子量與多級質譜碎片離子信息，共分析鑒定了60個化學成分(發(fā)酵前49個，發(fā)酵后22個)。其中，甾體皂苷類成分有42個，三萜類成分有3個，黃酮類成分有9個，生物堿類成分有6個，結果見圖1、表1。

注：A.發(fā)酵前；B.發(fā)酵后。圖1 黃精覆盆子發(fā)酵飲品的提取離子流圖

表1 發(fā)酵前后黃精覆盆子飲品中化學成分的質譜信息

分子式[M+H]+鑒定結果裂解碎片及豐度裂解碎片及方式理論值(m/z)實際值(m/z)誤差(×10-6)峰號tR發(fā)酵前發(fā)酵后來源C10H14O4N5腺苷MS2[268]:136(100),268(10),250(1)MS2[268]:136(M+H-D-Rib),250(M+H-H2O)268.104 03268.103 58-1.681?3.43++黃精/山藥C9H12O2Npolygonatine A or isomerMS2[166]:120(100),166(5),148(3)MS2[166]:120(M+H-CO-H2O),148(M+H-H2O)166.086 25166.086 20166.085 94166.086 09166.085 89166.085 80-0.33-1.89-0.99-2.19-2.742348124.9911.9012.1717.0422.66-++--++-++黃精黃精黃精黃精黃精C39H61O13kingianoside B or isomerMS2[737]:575(100),557(7),397(5)MS2[737]:575(M+H-Glc),557(M+H-H2O-Glc),397(M+H-O-Glc-Gal)737.410 66737.415 16737.417 54737.408 63737.408 334.093.31-2.76-3.17511405013.8420.8335.7038.00--++++--黃精黃精黃精黃精C32H51O9huangjinoside C or isomerMS2[579]:561(100),419(39),269(38)MS2[579]:561(M+H-H2O),419(M+H-CO-Ara)579.352 76579.347 78579.348 69579.351 32579.350 59-4.59-3.02-2.48-3.7467515215.2316.0238.2438.81--+++--+黃精黃精黃精黃精C39H63O17huangjinoside LMS2[803]:478(100),785(38),461(2)MS2[803]:478(M+H-Glc-Gal),785(M+H-H2O),460(M+H-H2O-Glc-Gal)803.405 97803.401 73-2.28917.54-+黃精C15H13O6aromadendrinMS2[289]:271(100),243(14),216(6),272(5)MS2[289]:271(M+H-H2O),243(M+H-H2O-CO)289.070 66289.070 34-1.121018.43+-覆盆子C21H25O10phlorizinMS2[437]:293(100),185(3),275(3)MS2[437]:275(M+H-Glc)437.144 22437.140 81-3.801325.01+-覆盆子C27H31O16蘆丁MS2[611]:303(100),465(37),449(4)MS2[611]:303(M+H-Rha-Glc),465(M+H-Rha),449(M+H-Glc)611.160 66611.159 30-2.2214?25.46+-黃精/覆盆子

續(xù)表1

注：*與對照品比對鑒定；+為檢測到；-為未檢測到；Glc為葡萄糖基；Rha為鼠李糖基；Gal為半乳糖基；Ara為阿拉伯糖基；Fuc為巖藻糖基；D-RibD為核糖基；EF為甾體皂苷的E、F環(huán)。

3.1 甾體皂苷類成分的分析鑒定

甾體皂苷類化合物是黃精的主要藥效成分和特征性成分，具有調節(jié)血糖、調節(jié)免疫、抗腫瘤、抗抑郁、改善學習記憶等作用[9]。該類成分的母核主要有菝葜皂苷元、薯蕷皂苷元及毛地黃糖苷元等[10]。其中，薯蕷皂苷元為甾體皂苷元骨架的一級氧化水平，是高氧化甾體皂苷元生物合成的前體化合物。在多個級別的氧化水平上，借助不同位置的氧化反應，若干多氧取代化合物的產生構成了黃精屬甾體皂苷元的分子多樣性[11]。此外，糖基部分的結構也是形成黃精屬植物甾體皂苷分子多樣性的關鍵因素，其連接糖基的主要有半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖及巖藻糖等。本實驗共鑒定了42個甾體皂苷類成分，以下選擇代表性的甾體皂苷元和皂苷為例進行結構解析過程的闡釋。

在正離子模式下，M59的準分子離子峰[M+H]+為m/z417.335 45，推測其分子式為C27H45O3，誤差為-2.08×10-6。在其 ESI-MS2圖譜中，產生了碎片離子m/z399和m/z271。推測m/z399是由m/z417脫去1分子H2O產生的，m/z271由m/z417丟失EF環(huán)和1分子CH3形成。通過與對照品的多級質譜裂解行為與保留時間進行比對，可將M59準確鑒定為菝葜皂苷元。

M60的準分子離子峰[M+H]+為m/z415.319 70，可知其分子式為C27H43O3(誤差-2.34×10-6)。在其二級質譜圖中，產生了m/z397[M+H-H2O]+、271[M+H-EF環(huán)]+和253[M+H-EF環(huán)-H2O]+等碎片離子。結合對照品比對和相關文獻[12]，可將M60準確鑒定為薯蕷皂苷元。

M31的色譜保留時間為32.99 min，其準分子離子峰[M+H]+為m/z915.457 76，推測其分子式為C45H71O19，誤差為-0.70×10-6。在多級質譜裂解過程中，m/z915通過丟失1分子H2O產生碎片離子。而另一個碎片離子m/z431[M+H-2Glc-Gal]+的產生表明結構中存在2個葡萄糖基團和1個半乳糖基團。推斷M31可能為pratioside D1。

m/z869.451 54為M34正離子模式的準分子離子峰[M+H]+，分子式為C44H69O17(誤差-1.59×10-6。在其 ESI-MS2圖譜中，m/z869產生了碎片離子707[M+H-Glc]+和571[M+H-Glc-EF環(huán)]+，表明其分子結構中存在葡萄糖基團。由此可將M34鑒定為kingianoside K。

3.2 三萜類成分的分析鑒定

覆盆子中含有較為廣泛的萜類成分，二萜類和三萜類是其特征性成分，其中尤以三萜類成分居多。三萜類化合物的母核主要為熊果酸型和齊墩果烷型，以熊果酸型居多，此類化合物多以結合態(tài)存在，成苷后糖大多連在28位[13]。本實驗共鑒定了3個三萜類成分，發(fā)酵前有3個，發(fā)酵后有1個。

M56的色譜保留時間為43.94 min，其準分子離子峰[M+H]+為m/z489.355 93。根據(jù)由高分辨質譜所獲得的精確分子量推測其最可能的分子式為C30H49O5，誤差為-3.10×10-6。在二級質譜圖中，[M+H]+離子產生了m/z471[M+H-H2O]+、453[M+H-2H2O]+、435[M+H-3H2O]+、417[M+H-4H2O]+和 373[M+H-2H2O-CO2]+等一系列碎片離子。這些離子的產生證明該分子結構中存在羧基和多個羥基。由此可將M56鑒定為阿江欖仁酸(arjunic acid)。

在正離子模式下，M57的準分子離子峰[M+H]+為m/z473.363 71，推斷其最可能的分子式為C30H49O4，誤差為2.47×10-6。在質譜裂解過程中，m/z473脫去1分子CO2產生二級碎片離子m/z429，m/z429進一步丟失1分子H2O生成m/z411。以上裂解過程表明該分子結構中含有羧基和羥基。因此，M57被鑒定為山楂酸(maslinic acid)。

M58在正離子模式下的準分子離子峰[M+H]+為m/z503.334 96，其可能的分子式為C30H47O6(誤差-3.48×10-6)。m/z503分別脫去1分子H2O、2分子H2O和3分子H2O產生ESI-MS2碎片離子m/z485、m/z467和m/z449，m/z485進一步裂解，脫去1分子CO生成m/z457。以上質譜裂解過程表明，該分子結構中存在羧基和多個羥基。由此可將M58鑒定為2α，19α，24-三羥基熊果-12-烯-3-酮基-28-酸(2α，19α，24-trihydroxyurs-12-ene-3-oxo-28-acid)。

3.3 黃酮類成分的分析鑒定

黃精和覆盆子中均含有黃酮類成分，其存在形式既有游離型的，也有與糖結合形成苷的。黃酮類化合物以C6-C3-C6 為基本骨架，根據(jù)中間三碳鏈的氧化程度、苯基連接位置以及三碳鏈是否呈環(huán)狀等特點，分為不同的類型。該類成分具有廣泛的藥理作用，如降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗菌及抗炎等。本實驗總共檢測到9個黃酮類成分，發(fā)酵前有9個，發(fā)酵后2個。

在正離子模式下，M14的色譜保留時間為25.46 min，其準分子離子峰[M+H]+為m/z611.159 30，推測其可能的分子式為C27H29O16(誤差-2.22×10-6)。m/z611相繼脫去1分子鼠李糖基和1分子葡萄糖基生成碎片離子m/z303。同時，二級碎片離子m/z465[M+H-Rha]+和m/z449[M+H-Glc]+的存在，也表明該分子結構中存在鼠李糖(Rha)基團和葡萄糖(Glc)基團。結合對照品比對和文獻參考[14]，可將M14準確鑒定為蘆丁。

M55的準分子離子峰[M+H]+為m/z287.054 26，其色譜保留時間為42.05 min，其分子式可能為C15H11O6，誤差為-2.62×10-6。其二級碎片離子m/z269是由m/z287脫去1分子H2O產生，m/z269進一步脫去1分子CO生成m/z241，表明其結構中存在羥基和羰基。同時，碎片離子m/z165[M+H-C6H6O-CO]+的產生，表明該分子結構中存在羥基和苯環(huán)。此外，黃酮母核經逆狄爾斯-阿爾德反應(RDA)重排C環(huán)開裂并丟失B環(huán)產生碎片離子m/z153[M+H-C6H6O-C2OH]+。結合對照品的保留時間和裂解規(guī)律[15]，可將M55準確鑒定為山柰酚。

M20在正離子模式下的色譜保留時間為28.44 min，其準分子離子峰[M+H]+為m/z595.164 06，推測其可能的分子式為C27H31O15，誤差為-2.83×10-6。在ESI-MS2圖譜中，產生了m/z287、m/z499和m/z577等碎片離子。m/z595脫去1分子Rha生成m/z499，m/z499繼續(xù)脫去1分子Glc產生m/z287，提示該分子中含有鼠李糖基團和葡萄糖基團。此外，m/z577[M+H-H2O]+的存在表明結構中含有羥基。由此，M20被鑒定為煙花苷(nicotiflorin)。

3.4 生物堿類成分的分析鑒定

黃精和山藥中尚含有少量的生物堿類成分，這些化合物藥理活性眾多，主要為抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒以及殺蟲等。本研究鑒定了6個生物堿類化合物，包括發(fā)酵前3個和發(fā)酵后5個。

在正離子模式下，M1的色譜保留時間為3.43 min，其準分子離子峰[M+H]+為m/z268.103 58，其分子式可能為C10H14N5O4，誤差為-1.68×10-6。m/z136和250為其ESI-MS2碎片離子。其中，m/z268丟失1分子D-Rib生成m/z136(表明母核結構中含有核糖)，m/z268丟失1分子H2O產生碎片離子m/z250(表明母核結構中存在羥基)。結合對照品比對，將M1準確鑒定為腺苷。

4 結論

基于UPLC-HRMS技術，本研究對發(fā)酵前后黃精覆盆子飲品中的化學成分進行了分析檢測。通過分析精確分子量、多級碎片信息，結合對照品和相關文獻，本實驗共鑒定了60個化學成分，包括42個甾體皂苷，3個三萜，9個黃酮和6個生物堿。這些化學成分有53個來源于黃精，12個來源于覆盆子，2個來源于山藥。其中，從發(fā)酵前黃精覆盆子飲品中分析鑒定了49個成分，從發(fā)酵后黃精覆盆子飲品中分析鑒定了22個成分。結果表明，該飲品中的大多數(shù)黃酮類成分和三萜類成分在發(fā)酵之后消失；部分甾體皂苷類成分，如化合物康定玉竹苷D1(pratioside D1)，滇黃精皂苷K(kingianoside K)以及黃精皂苷(huangjinoside)D、E、P，新西伯利亞蓼苷D(neosibiricoside D)和它們的同分異構體在發(fā)酵后幾乎消失；而腺苷、山柰酚、菝葜皂苷元和薯蕷皂苷元等成分在發(fā)酵前后均存在。本實驗基本闡明了發(fā)酵前后黃精覆盆子飲品中的化學成分，可為其化學成分的進一步研究和質量評價提供參考。