RU486通過Notch1/Hes-1信號通路對糖尿病大鼠視網膜神經節細胞的保護作用及機制研究*

劉文強，劉學政，左中夫

錦州醫科大學基礎醫學院解剖學教研室(錦州 121001)

體內糖皮質激素(Glucocorticoid,GC)含量增加為糖尿病的重要表現之一[1]。有學者報道，小劑量GC治療糖尿病視網膜病變(Diabetic retinopathy,DR)具有明顯的療效，但過量或延長使用療程會引起眼內并發癥[2]。本研究前期研究發現，應用RU486對抗體內過多的GC可改善DR狀態下視網膜神經節細胞(Retinal ganglion cell,RGC)損傷[3]，但具體機制不清。Notch1與神經元受損后修復密切相關，與Mash-1基因、Hes-1基因聯系密切[4]。因此，本研究在應用RU486的情況下加用Notch1通路抑制劑，進而探討RU486治療DR的具體機制。

材料與方法

1 實驗動物與試劑儀器 雄性SD大鼠40只，體質量220～250g (購自錦州醫科大學，0000455)。鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ,Sigma)；大鼠內源性GC試劑盒(上海信帆公司)；HE 染色試劑盒(碧云天公司) ；Notch1、Hes-1、GAP-43抗體( Abcam公司)；免疫熒光、Western 印跡二抗(PTG公司)。熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；冰凍切片機(德國SLEE公司)；水平電泳儀(美國BIO-RAD公司)。

2 研究方法

2.1 動物分組及模型制備：大鼠隨機分成對照組(CON)、糖尿病組(DM)、RU486治療組(RU486)及RU486+DAPT組四組，每組10只。后三組大鼠按50 mg/kg腹腔注射STZ，72 h后測血糖，將血糖濃度大于16.7 mmol/L的大鼠定為糖尿病模型。以二甲基亞砜 (Dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解RU486，參照文獻[5]，RU486組及RU486+DAPT組大鼠腹腔注射RU486，注射劑量為20 mg/(kg·d)，RU486+DAPT組給予DAPT 5 μl(10 μmol/L)玻璃體內注射給藥(雙側眼球均給藥)[6]，CON組及DM組給予等劑量DMSO，12周后進行各項指標檢測。實驗遵循國家《實驗動物管理條例》。

2.2 樣本制備:12周后，在各組大鼠尾靜脈取血3 ml，5000 r/min離心30 min后取上清，運用ELISA法，檢測血清GC濃度，操作按試劑盒說明書執行。每組取5只大鼠，固定后取出眼球，石蠟包埋切片，厚度為5 μm，常溫保存，用于免疫熒光及HE染色。每組另取5只大鼠取視網膜，裂解，冰上剪碎，冰上靜置30 min 后4℃以2000 r/min離心25 min，留上清，-20℃保存用于Western 印跡。

2.3 免疫熒光檢測大鼠視網膜Notch1表達:經2.2制備的脫蠟后切片浸于PBS洗滌3次，每次3 min；3%山羊血清+0.3% Triton-100室溫孵育1 h；不洗，滴加兔抗大鼠Notch1(1∶500)，4℃過夜；PBS洗滌4次，每次3 min；滴加熒光二抗，常溫1 h；PBS洗滌4次，每次3 min；封片后熒光顯微鏡觀察。

2.4 Western 印跡檢測Notch1、Hes-1、GAP-43蛋白相對表達：取2.2制備的上清，BCA法測蛋白濃度并制樣，電泳分離后轉入PVDF膜，1%BSA室溫封閉2 h。一抗(兔抗大鼠Notch1，1∶10000；兔抗大鼠Hes-1，1∶5000 ；小鼠抗大鼠GAP-43，1∶20000)，4℃搖床雜交過夜。二抗室溫2 h。ECL顯色，以β-Tubulin為內參，Image J軟件分析灰度值。

2.5 HE染色檢測RGC密度：經2.2制備的切片浸于PBS洗滌3次，每次3 min；滴加蘇木素，2 min；PBS中1 min，自來水沖洗；95%酒精1 min；伊紅浸染，2 min，自來水沖洗；脫水透明后封片，拍照后應用Image J 軟件計數RGC數量并轉化成密度。

結 果

1 各組大鼠血清GC水平檢測結果 四組血清GC相比，總體具有統計學差異(F=75.36,P< 0.05)。與CON組相比，DM組、RU486組及RU486+DAPT組血清GC濃度明顯增加(P< 0.05)，而DM組、RU486組及RU486+DAPT組之間比較無統計學差異(P> 0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清GC和視網膜Notch1熒光強度

注：與CON組相比，*P<0.05；與DM組相比，#P<0.05

2 免疫熒光檢測各組大鼠視網膜Notch1的表達 將CON組Notch1蛋白免疫熒光強度設定為100.00%，四組之間相比，總體具有統計學差異(F=245.73,P< 0.05)。與CON組相比，DM組及RU486+DAPT組Notch1表達明顯降低，而與DM組相比，RU486組Notch1表達明顯增加 (均P<0.05)，而DM組與RU486+DAPT組之間比較無統計學差異(P> 0.05)(圖1)。見表1。

3 Western 印跡檢測視網膜Notch1、Hes-1、GAP-43蛋白相對表達量 與CON組相比，DM組及RU486+DAPT組GAP-43表達有所增加，Notch1和Hes-1表達明顯降低(均P< 0.05)。與DM組相比，RU486組Notch1、Hes-1及GAP-43表達均明顯增加(均P< 0.05)(圖2)，見表2。

4 HE染色檢測視網膜RGC 四組之間相比總體具有統計學差異(F=1264.82,P< 0.05)。與CON組相比，DM組及RU486+DAPT組RGC密度明顯降低(P< 0.05)。

A：CON組；B：DM組；C：RU486組；D：RU486+DAPT組；GCL：節細胞層；INL：內核層

圖1 免疫熒光檢測Notch1在視網膜的表達(×200)

A：CON組；B：DM組；C：RU486組；D：RU486+DAPT組

圖2 Western 印跡檢測視網膜Notch1、Hes-1、GAP-43蛋白相對表達

與DM組相比，RU486組RGC密度明顯增加(P< 0.05)，而DM組與RU486+DAPT組之間比較無統計學差異(P> 0.05)。見表2、圖3。

表2 各組大鼠視網膜Notch1、Hes-1、GAP-43蛋白相對表達和 RGC密度

注：與CON組相比，*P<0.05；與DM組相比，#P<0.05

A：CON組；B：DM組；C：RU486組；D：RU486+DAPT組；GCL：節細胞層

討 論

DR可引起RGC凋亡甚至死亡，表現為RGC數量的減少[7]。RGC軸突形成視神經，RGC損傷會影響患者的視力。因此，促進RGC再生增加其數量對防治DR尤為重要[8]。正常情況下，體內GC的增加會反饋于下丘腦、垂體，進而減少GC的釋放。然而DR狀態下，HPA軸反應性降低，GC對HPA軸負反饋作用減弱，促使GC濃度進一步增加[9]。RU486為GC的競爭性抑制劑，可阻礙GC與受體的結合，進而拮抗GC的作用。本研究發現，DR時血清GC濃度異常升高，RGC密度明顯減少。RGC密度的降低可能由高血糖所致，亦可能由GC濃度的增加引起GC的慢性損傷所致。而RU486治療后，RGC密度較DM組有所提高，提示針對GC的治療對改善RGC損傷是有益的。有研究發現，針對STZ誘導的1型糖尿病大鼠給予RU486治療9 d后，可明顯改善糖尿病引起的認知功能障礙[10]。亦有研究證實RU486對抑制糖尿病引起的實驗性牙周炎具有較好的緩解作用[11]。因此，RU486針對糖尿病引起的GC濃度誘導的多種并發癥具有很好的療效。GAP-43為神經元再生的首選標志物，在神經元受損時表達明顯上調[12]。本研究發現，DR時GAP-43表達有所提高，這可能是RGC對損傷的反應，這可能為RGC再生提供了條件。而應用RU486治療后，GAP-43表達明顯增加，伴隨著RGC密度亦明顯增多，提示針對GC濃度的增加進行治療，可能促進RGC的再生，進而增加RGC密度。

Notch1信號可調節神經元生長，與神經元受損后的修復及再生密切相關[4]。通過上調Notch1表達，有助于周圍神經元再生。本課題組前期發現，DR狀態下Notch1信號通路受到抑制，激活該通路可上調視網膜GAP-43表達，下調Caspase-3表達，進而提高RGC的存活。本研究發現，與CON組相比，DM組Notch1表達明顯下降，同時Notch1下游的關鍵位點Hes-1表達亦下降，這提示DR損傷會造成Notch1通路的抑制。而應用Notch1通路的抑制劑DAPT后RU486的治療作用被逆轉。因此，可以證實，RU486主要通過激活Notch1信號通路保護受損的RGC。

綜上所述，DR狀態下，Notch1通路的抑制會引起RGC密度的降低，而應用RU486后，可明顯改善DR時的RGC損傷。進一步在RU486基礎上加用Notch1通路的抑制劑DAPT后可逆轉RU486的作用。這提示RU486對DR狀態下RGC的保護作用與激活Notch1/Hes-1信號通路有關。